[发明专利]一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该载体由于含有FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、RLuc表达框以及用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点等基因片段，因此同时具备报告基因载体、shRNA真核表达载体和内参载体这三个功能。在进行双萤光素酶报告基因实验时，仅需要向细胞转染一个该载体，即可替代传统实验共同转染三个载体的操作，彻底解决了由于三个载体比例出现偏差所引起的萤光素酶活力比值的波动问题，能够增强双萤光素酶报告系统的信噪比，提高筛选抑制靶基因表达shRNA的准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于准确筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)介导的沉默或抑制目标基因表达的过程，该技术已广泛应用于基因功能、肿瘤发生发展及基因治疗等研究领域。为了使特定基因沉默表达，可针对该基因序列信息设计不同靶点的shRNA，但不同的shRNA所引起的沉默表达程度往往存在差异。因此，准确高效的筛选能够有效抑制靶基因表达的shRNA是应用RNAi技术进行研究和应用的基础。

双萤光素酶报告基因实验(Dual-Luciferase Assay)是检测shRNA对靶基因表达抑制程度的首选研究方法。该方法的基本原理是将靶基因构建到萤火虫萤光素酶(FireflyLuciferase,FLuc)基因的3'非翻译区，使靶基因跟随FLuc基因一同转录为嵌合mRNA。若shRNA对靶基因具有抑制作用，则会降低FLuc/靶基因嵌合mRNA的稳定性，导致FLuc表达量下降，引起FLuc活力减弱。shRNA对靶基因的抑制作用越强，FLuc活力降低的程度越明显。为了减小细胞活性和转染效率等外在因素对FLuc活力测定的影响，常在细胞中同时组成性表达海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,RLuc)作为内参，为试验提供基准线。双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达FLuc和RLuc，两者来源于不同物种并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。

目前，应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shRNA的传统实验方法需要构建三个载体，一是将靶基因构建至FLuc基因3'非翻译区的报告基因载体，二是产生待筛选shRNA的真核表达载体，三是表达RLuc的内参载体。实验中需要将上述三个载体按照一定比例混合后，共同瞬时转染细胞，而后分别测定FLuc和RLuc活力，计算二者比值，比值越低表示shRNA对靶基因表达的抑制效果越强。然而在具体操作中，研究人员发现虽然在实验中使用RLuc作为内参对照，但是由于受到无法避免的加样误差和细胞转染效率差异等因素的干扰，使得实际进入各个细胞的三个载体的比例必然不会完全相同，导致即使相同shRNA实验组的不同重复样本的荧光素酶活力比值之间往往存在较大的波动，大大削弱了实验的准确性和可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该载体同时具备报告基因载体、shRNA真核表达载体和RLuc内参载体三个功能，能够解决传统实验方法应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shRNA时测定结果波动较大、重复性差的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体包括CMV启动子、FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、SV40PolyA结构、RLuc表达框、HSV-TK启动子、大肠杆菌启动子、SV40启动子、SV40复制起点、Kan/Neo抗性基因、用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点和HSV-TK PolyA结构。