[发明专利]人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法、试剂盒及体系

权利要求书

1.一种人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法，其特征在于，包括：

在荧光PCR体系中，以含有人KRAS基因突变位点的DNA作为模板进行荧光PCR反应，其中所述荧光PCR体系中包括：

(a)用于检测KRAS Gly12Asp突变位点的上游引物序列：

GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGA(SEQ ID NO：1)，

用于检测KRAS Gly12Ala突变位点的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGC(SEQ ID NO：2)，

用于检测KRAS Gly12Val和Gly12Ser突变位点的上游引物序列：

GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGT(SEQ ID NO：3)，

用于检测KRAS Gly12Arg和Gly12Cys突变位点的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGdITC(SEQ ID NO：4)，

用于检测KRAS Gly13Asp突变位点的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGdIGT(SEQ ID NO：5)，

其中，所述上游引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；

(b)用于检测KRAS各种突变位点的下游引物序列：

CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT(SEQ ID NO：6)；

(c)用于检测KRAS各种突变位点的荧光探针序列：

GAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTC(SEQ ID NO：7)，

其中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团；

(d)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和PCR缓冲液；

(e)第一添加剂和第二添加剂，所述第一添加剂包括牛血清白蛋白，所述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光基团是FAM，所述淬灭基团是BHQ1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR体系中还包括：

用于KRAS监控的内标序列，包括：

上游引物序列为：CCTAGTAGGAAATAAATGTGATTTGCC(SEQ ID NO：8)，

荧光探针序列为：

TAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTT(SEQ ID NO：9)，

下游引物序列为：CTGTCTTGTCTTTGCTGATGTTTCA(SEQ ID NO：10)，

其中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每50μL所述荧光PCR体系中含有：

Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；10μM的引物序列各自1～2μL，10μM的探针序列3～4μL；含有人KRAS基因突变位点的DNA 20～40ng；10mg/mL牛血清白蛋白2μL，二甲基亚砜、250mM NH₄Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述每50μL所述荧光PCR体系中还含有：

10μM的所述内标的引物序列各自1μL，以及10μM的所述内标的探针序列0.5μL；所述内标的引物序列和探针序列包括：

用于KRAS监控的内标序列，包括：

上游引物序列为：CCTAGTAGGAAATAAATGTGATTTGCC(SEQ ID NO：8)，

荧光探针序列为：

TAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTT(SEQ ID NO：9)，

下游引物序列为：CTGTCTTGTCTTTGCTGATGTTTCA(SEQ ID NO：10)，

其中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。