[发明专利]人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法、试剂盒及体系

说明书

技术领域

本发明涉及基因甲基化水平检测技术领域，尤其涉及一种人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法、试剂盒及体系。

背景技术

粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使从粪便中提取的DNA质量较好。因此粪便基因甲基化作为一种新的、敏感度高、特异性中等的无创性结直肠肿瘤标志物，能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，作为相关肿瘤的早期筛查手段具有很重要的临床价值。

石蜡组织切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，还用于研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要手段，由于生物组织经过固定、石蜡包埋后能够完好的保存其形态结构，大量的细胞内DNA遗传物质得以完好保存在石蜡组织当中，经过脱蜡、细胞消化、DNA提取等步骤能够将这些保存下来的DNA遗传物质释放出来。同时，石蜡组织切片也是一种短期内获取大量人体新鲜组织标本的有效方式，且部分研究涉及回顾性分析，也需要借助于病理科等长期保存的福尔马林固定石蜡包埋组织。因此，无论是作为相关肿瘤的早期筛查手段，还是从基因水平阐明肿瘤发病机制，石蜡切片组织都具有很重要的早期检测、研究用临床价值。

RAS基因家族与人类肿瘤密切相关的基因有三种HRAS、KRAS和NRAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90％的氨基酸序列同源，分子量均为21KDa，又称为RASp21蛋白。KRAS信号通路是EGFR和其他信号转导的下游通路，当RAS基因发生突变时，其编码的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信号转导通路一直处于持续激活状态，刺激细胞不断增殖分化，最终导致细胞恶变。KRAS突变基因是一种常见的致癌基因，多见于恶性肿瘤，结直肠癌患者中约有30％～40％存在KRAS基因突变，肺腺癌患者中约有15％～30％存在KRAS突变。KRAS突变主要定位在第12、13、61和63号密码子，其中有7个突变热点：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg和Gly13Asp共7类热点突变，占KRAS基因总突变的90％以上。

研究表明，KRAS基因突变与NSCLC对吉非替尼、厄洛替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。有研究发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。NCCN(非小细胞肺癌临床实践指南2016版)指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFT-TKI)产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN(非小细胞肺癌临床实践指南2016版)提出肺腺癌患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。因此对KRAS基因突变继续风险预测，可作为EGFR靶向治疗耐药性产生与否的重要预测指标。

目前临床检测DNA中基因突变的方法主要有3种：1)直接测序法，是目前应用最多的一种检测方法，主要是Sanger测序，当突变基因得到有效富集之后，才能被测序，优点是结果准确可靠，能读取到被检测序列信息，但其有效富集突变基因区域，及在突变基因含量低的情况下面临极大的挑战，一般用来确认其他检测阳性结果。2)荧光定量PCR法，在荧光定量PCR平台上，利用特异的引物对DNA突变靶序列进行PCR扩增，利用荧光标记探针对扩增产物进行突变检测，这样检测方法特异性强、灵敏度高，可检测到DNA含量低至1％的突变，但目前单管单一突变检测通量低，探针成本昂贵，很难适应临床大通量样本的风险预测。3)高通量测序技术法，一般利用PCR技术对目标区域进行富集，然后构建适合于NGS上机测序的文库，最后上机测序，信息分析获得感兴趣目标区域序列信息。但是在目前对目标区域富集过程中，富集的特异性和有效性在不同的实验平台差距大，而且普通的建库流程繁杂，周期长，成本高，这些因素都造成是否需要进行高通量测序的限制因素。

因此，目前急需一种提高通量、结果判别快速清晰的各种生物样本当中KRAS 基因突变进行风险预测的方法，为临床提供是否需要进行进一步区分突变类型、或进行高通量测序提供判断依据。

发明内容

本发明提供一种人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法、试剂盒及体系，在单管PCR反应中联合检测KRAS基因第12位和第13位密码子上的7种热点突变。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种人KRAS基因多点突变单管联检荧光PCR方法，包括：