[发明专利]一种发酵生产杆菌肽的方法

说明书

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产杆菌肽产量的方法。该方法通过1）优化有机复合氮源和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性，降低了杂质F含量；2）在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。发酵结束后，杆菌肽的发酵单位可达1228U/ml，比优化前可使杆菌肽产量提高123%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产杆菌肽的方法。

背景技术

杆菌肽是一种由12种氨基酸组成的噻唑肽类窄谱抗生素，主要由特雷斯氏枯草杆菌和地衣芽孢杆菌发酵产生，对革兰氏阳性球菌和杆菌有效，对少数革兰氏阴性菌、螺旋体及放线菌也有一定的抑制作用。杆菌肽具有高效、低毒、残留量少等优点。因此，杆菌肽不仅是一种重要的抗生素药物，也是安全性良好的畜禽抗生素饲料添加剂。

杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，含有杆菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等化学结构类似的异构体，其主要活性成分为杆菌肽A，分子式为C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S。杆菌肽F是杆菌肽A的降解产物，有肾毒性，需严格控制其含量。

杆菌肽是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀，杆菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。

在现有技术中，杆菌肽发酵具有其自身的特点，在大规模生产中也面临着一些需要解决的难题。

1）杆菌肽最终效价、杂质F的含量受发酵过程中温度影响很大。随着发酵温度的升高，杆菌肽效价增加，但同时杂质F的比例大幅度的增加。例如常规的杆菌肽发酵过程中，当发酵温度是37℃时杂质F的比例高达10%。

2）杆菌肽为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中。杆菌肽不仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用。随着杆菌肽在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成杆菌肽的产率难以提高，从而成为制约提高杆菌肽发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度杆菌肽的产生菌固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。添加大孔吸附树脂也可降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，使杆菌肽产量提高11%以上，但大孔树脂的加入导致菌丝过早断裂并衰亡，存在发酵终点明显提前的弊端，加入的大孔树脂和菌丝混在一起，无法有效分离。3）杆菌肽是肽类抗生素，由一系列氨基酸通过酶催化合成，因而氮代谢对杆菌肽的合成影响明显。而目前的有机氮源大多为大宗农副产品，其质量受产地、加工方式等影响，造成大规模生成中不同发酵批次间菌种的次级代谢水平不一致，进而影响下游纯化，最终影响产品质量。

酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年发展起来的有机氮源。其中棉籽蛋白粉是一种以特定地区的优质棉籽为原料，采用先进的技术生产的高蛋白、低酚、低纤维、微生物利用效果好的有机氮源，产品的蛋白含量在50%以上，氨基酸组成占总氮的90%以上，游离棉酚的含量控制在600ppm以下，产品质量稳定。酵母粉为标准化有机氮源，蛋白质含量高（蛋白质占干菌体总重50%以上），含有18种氨基酸，种类齐全，维生素和矿物质等含量丰富。但未见有报道将两种有机氮源配合应用于地衣芽孢杆菌生物合成杆菌肽。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备杆菌肽存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方（特别是氮源类型）、发酵条件（如发酵温度），在发酵过程的特定时间段中添加超顺磁性微球，减少反馈抑制，来提高杆菌肽产量的方法。

本发明的关键构思为：采用地衣芽孢杆菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产杆菌肽过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化复合有机氮源，在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，提高杆菌肽的产量。