[发明专利]ctDNA超低频突变检测文库的构建方法、试剂盒及文库检测数据的分析方法

权利要求书

1.一种ctDNA超低频突变检测文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，从全血中提取cfDNA；

S2，对所述cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；

S3，将所述S2得到的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；

S4，根据所述接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，所述多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配所述接头的序列，下游引物为扩增所述目标区域的特异性引物；

S5，对所述S4的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；以及

S6，对所述S5的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到所述ctDNA超低频突变的文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述随机标签序列的长度为12bp。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述接头为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。

4.一种用于ctDNA超低频突变检测文库构建的试剂盒，其特征在于，包括：cfDNA提取试剂、对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基的试剂、含有随机标签序列的接头、接头连接试剂、根据所述接头的序列及目标区域设计的多重PCR引物，所述多重PCR引物中上游引物为通用引物，匹配所述接头的序列，下游引物为扩增所述目标区域的特异性引物，对PCR产物进行磁珠纯化的试剂，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体的试剂，用于PCR扩增的试剂，将index序列引入DNA片段的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述随机标签序列的长度为12bp。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述接头包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。

7.一种文库检测数据的分析方法，所述文库为如权利要求1至3中任一项所述的ctDNA超低频突变检测文库，其特征在于，包括以下步骤：

S1，对所述文库测序后的数据通过随机标签序列进行聚类分析，排除掉PCR扩增错误及测序错误产生的序列数据；

S2，剩余的数据质控合格后进入变异检测分析。

8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，所述S2包括：采用samtools软件进行突变检测，并根据聚类完的标签序列进行计数，在同一标签中支持突变的reads占80％以上则计数，所有标签在同一个突变出现2次算作阳性检出，合并点突变检出结果，使用annovar软件进行注释，得到氨基酸水平突变注释。