[发明专利]ctDNA超低频突变检测文库的构建方法、试剂盒及文库检测数据的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种ctDNA超低频突变检测文库的构建方法、试剂盒及文库检测数据的分析方法。

背景技术

ctDNA(circulating tumor DNA)，即循环肿瘤DNA，是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，它们携带有肿瘤细胞中所有的基因突变信息，因此，理论上可以通过检测ctDNA的突变状态来反应肿瘤组织的突变状态。因为无论是原发部位肿瘤还是转移部位肿瘤，均在持续不断的向血液中释放肿瘤DNA，所以ctDNA体现的是患者整体的肿瘤基因突变情况，因而更加全面；仅仅需要抽取一管血液就可以进行检测的便利性，也使之克服了肿瘤组织难以取样和不方便长期监测的问题。因此，基于血液的无创或者微创的肿瘤基因检测技术备受关注，有着广阔的应用前景。

但是，在能够获得大规模临床应用之前，ctDNA检测技术还有几个技术瓶颈需要克服：1)人体正常细胞的凋亡，也会释放大量的游离DNA到血液中，这些游离DNA为ctDNA的检测制造了大量的背景噪音。一般认为，血浆中ctDNA占游离DNA的比例从0.1％到93％不等，因此，ctDNA检测技术需要克服的第一个瓶颈是超低频突变的检出。2)血液中游离DNA的总量很低，每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游离DNA，而肿瘤相关突变种类很多，常规技术无法使用这么少的DNA进行多项DNA突变检测实验。

对于多重基因的检测，目前最常使用的技术是二代测序(NGS)，以Illumina公司的Hiseq和Nextseq测序仪为代表的第二代测序技术，具有检测通量高(每次运行可以产生上百G的基因数据)，覆盖面广(可以进行人类全基因组的测序分析)，性价比高(平均每G成本仅需几十块钱)等优点，因此特别适用于多个基因的多种突变类型的并行检测。

在进行二代测序文库构建的过程中，无可避免地会进行PCR反应，而PCR的过程势必会引入碱基的错误。据报道，一般的高保真酶的复制错误率在10^-6左右，并且会随着PCR循环数的增多，这个数值还会增大；另外，目前测序精度最高的测序仪Hiseq和Nextseq的单碱基测序错误率都在0.01％-1％之间。以上这两点对于检测超低频的ctDNA突变会造成很大的背景噪音。在0.1％及以下的检测限的情况下，很难区分模板DNA的突变和PCR及测序的错误，这样会导致检测的特异度降低。

为了解决ctDNA的超低频检测背景噪音高的问题，目前常规的办法为提高测序深度，通过加大测序的数据量来增加变异检测时的reads(读段)支持数，从而排除测序错误。但是，由于ctDNA的模板含量低，大数据量会造成大量的复制品(duplicate)，测序深度的增加与数据量的增加并不是具有线性关系，因此，在造成数据浪费的同时还会由于测序深度的限制导致检测限并不是很高，通常只能检测0.5％左右的突变。另一种办法为通过模板DNA分子的内源性“标签”，即DNA分子两端的碱基序列来判定下机数据中的reads是否来自于同一条DNA原始分子，来源于同一条DNA原始分子的reads将会根据每条reads的突变情况确定真实的突变情况。但是，由于内源性“标签”所标记的DNA分子数有限，会出现多个DNA原始分子标签序列相同的情况，这样会导致检测的灵敏度下降。

发明内容

本发明旨在提供一种ctDNA超低频突变检测文库的构建方法、试剂盒及文库检测数据的分析方法，以提高ctDNA超低频突变检测灵敏度。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种ctDNA超低频突变检测文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，从全血中提取cfDNA；S2，对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；S3，将S2得到的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；S4，根据接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配接头的序列，下游引物为扩增目标区域的特异性引物；S5，对S4的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；以及S6，对S5的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到ctDNA超低频突变的文库。

进一步地，随机标签序列的长度为12 bp。

进一步地，接头包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。