[发明专利]鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12‑5外源基因插入染色体位置的方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供的鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，通过筛选与阴性转基因个体连锁的分子标记引物，并根据分子标记引物所在的位置确定外源基因的位置，能够实现对基因组相对复杂的物种如玉米，大豆等作物的外源基因插入位置的快速准确识别。此外，本发明还提供了该方法在转基因玉米双抗12‑5中的应用，准确识别了双抗12‑5中，外源基因插入染色体的位置。另外，本发明还提供了上述方法在转基因作物育种，分子特征安全性评价以及转基因产品溯源等方面中的应用，具有良好的应用前景和可观的市场价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法及其应用。

背景技术

最新数据表明：2015年，全球转基因作物种植面积达到1.81亿公顷，比1996年的170万公顷增长了100倍以上(James 2015)。以基因工程为核心的现代生物技术已广泛渗入到农业的各个领域，逐步改变了传统农业的研究和生产模式。转基因作物已被快速、持续地用于商业化生产。无论在发达国家还是发展中国家，转基因作物都对环境、经济、能源、卫生及社会产生了巨大影响。在我国转基因植物必须经过转基因植物安全评价后才能在国内进行种植并进行相关农产品的加工贸易，其中对于转基因外源片段插入在本体植物染色体的位置是对其分子特征安全性评价以及转基因产品溯源，鉴定的关键分子数据(CodexAlimentarius Commission 2003；OECD 1986,1992,2003；Sparrow 2010)。

目前鉴定转基因植物外源片断插入染色体位置的方法主要根据载体特异片段设计引物进行染色体步移的方式获取侧翼片段，然后通过生物信息学比对来确外源片断插入染色体位置(Codex 2003)，获得侧翼片段的方法主要有热不对称交错PCR(TAIL-PCR)等，通过这种方法成功的获得了我国自主研发的转基因水稻TT51-1和KF6等一系列转基因植物的外源基因插入位置(Cao et al.2011；Wang et al.2011)。然而这种方法在遇到像小麦，玉米等基因组复杂并且基因组中富含多个相似重复片段的物种时就很难通过序列比对的方式获取外源片段插入染色体位置的信息。

因此，就需要提供一种能够准确识别外源基因插入转基因植物染色体位置的方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，以准确的鉴定外源基因插入染色体的位置。

本发明提供的一种鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)以转基因植株和非转基因植株为亲本进行杂交，获得F1代，所述F1代自交获得F2代分离群体；

(b)从植物基因组数据库中，随机下载大量的SSR引物，再从所述SSR引物中，筛选出与所述转基因植株和所述非转基因植株存在多态性的多态性SSR引物；

(c)从所述F2代分离群体中筛选出阴性转基因个体；

(d)将所述多态性SSR引物与所述阴性转基因个体进行连锁分析，得到与所述阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，所述分子标记的引物在染色体的位置即为所述外源基因插入染色体的位置。

进一步的，所述植物包括玉米或者大豆。

进一步的，步骤(b)中，所述多态性SSR引物的筛选方法包括：

分别以所述转基因植株和所述非转基因植株的基因组DNA为模板，用所述SSR引物进行PCR，并对PCR产物进行分析，能够使所述转基因植株的PCR产物和所述非转基因植株的PCR产物不相同的所述SSR引物，即为所述多态性SSR引物。

进一步的，步骤(d)中，所述连锁分析的方法包括：