[发明专利]苋属的实时荧光PCR鉴定方法

说明书

本发明公开了一种苋属的实时荧光PCR鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：步骤1，取样本2g，液氮研磨至粉末状，取0.2g研磨后的粉末状样品用试剂盒提取DNA，将提取到的DNA溶解在50μL去离子水中，将得到的DNA样品置于‑20℃冰箱保存、备用；步骤2，基于叶绿体的PsbA基因，设计选取具有苋属特异性的引物和探针，步骤3，TaqMan实时荧光PCR：将步骤2设计选取的引物和探针对步骤1中的DNA样品进行荧光PCR扩增反应，通过荧光PCR扩增后得到Ct值，通过Ct值对样品是否含有苋属进行判定。本发明利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性的片段，有效解决了形态学鉴定的不足。

技术领域

本发明属于苋属的鉴定方法，具体涉及一种苋属的实时荧光PCR鉴定方法。

背景技术

当外来物种在非原产地新生态环境中建立种群，进一步传播扩散改变或威胁本地生物多样性且带来一定危害与影响的时候，就成为外来入侵物种(Alien invasivespecies)。中国国土广袤，幅员辽阔，自然地理条件复杂，无论栖息地类型还是结构均呈现多样化的特征，几乎适宜任何外来物种归化。植物入侵一般比动物入侵更频繁，更常见，入侵物种数量更大，危害程度更高。植物入侵意味着外来植物取代土著植物，直接导致土著植物多样性降低，最终导致生态系统多样性的改变。据调查研究显示，中国外来入侵植物约500种，主要集中在菊科(Compositae)、豆科(Leguminosae)、禾本科(Gramineae)等几个科中，优势属中较为突出的是苋属(Amaranthus)。苋属植物作为粮食、蔬菜、观赏以及染料植物，对生态环境、人类活动等产生积极影响，但该属的刺苋(A.spinosus)、反枝苋(A.retroflexusL.)、长芒苋(A.palmeri S.Watson)等属于杂草，具有感化潜力，特别是刺苋，对生长在其周围植物的萌发和光合速率都会有一定的影响，降低多种作物的生长和产量。

入侵生物的传播途径主要有3种：一种是有意识引进，即人为引进具有一定经济价值、实用价值的物种，最后演变为入侵种；二是无意识引进，即随着贸易、运输、旅游等活动而传入的物种演变而成的入侵种；三是自然入侵，即通过物种自身的扩散能力或者借助自然条件而实现的入侵。据悉，中国外来入侵植物中约50％是由于检疫人员疏漏，随贸易品、运输工具等方式引进，即无意识引进。但随着贸易全球化，人为活动范围的扩大，进出口贸易量的与日俱增，无疑对检疫工作提出了更高的要求。而检疫工作中面临的业务量大、鉴定专家匮乏也是实际存在的困难，特别是植物物种鉴定通常以传统的形态学鉴定为主，若植物以种子、果实等形态出现，或形态学信息不足等都会使鉴定面临困难。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种苋属的实时荧光PCR鉴定方法，本发明基于植物叶绿体基因的保守片段，研究了苋属植物的实时荧光PCR快速鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种苋属的实时荧光PCR鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：

步骤1，苋属DNA提取：

取样本2g，液氮研磨至粉末状，取0.2g研磨后的粉末状样品用试剂盒提取DNA，将提取到的DNA溶解在50μL去离子水中，将得到的DNA样品置于-20℃冰箱保存、备用；

步骤2，特异性引物和探针的设计：

基于叶绿体的PsbA基因，设计选取具有苋属特异性的引物和探针，所述特异性引物和探针分别为：

F：AGGAGCAATGCCGTTTTCTT，

R：CAGTATTCAGAACTTGCCTTTGA，

P：FAM-TGTCAAGAAATTGGTTATTGCTCC-Eclipse，

步骤3，TaqMan实时荧光PCR：