[发明专利]一种基于直接竞争酶联免疫法检测铬离子试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于直接竞争酶联免疫法铬离子检测试剂盒，包括：

(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL；

(2)质量浓度为30～40μg/mL的酶标Cr-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

(3)质量浓度为13～18μg/mL的抗铬离子单克隆抗体溶液；所述抗铬离子单克隆抗体溶液由Cr-ITCBE-BSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；

(4)1.0～3.0mol/L的终止液；

(5)样品稀释液；

(6)底物显色液；

(7)洗涤液；

(8)铬离子标准品溶液；

(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液；

所述样品稀释液为质量浓度为2～10g/L的HEPES缓冲液；

所述洗涤液为包含质量浓度0.05～0.1％Tween20的PBS溶液；

所述Cr-ITCBE-cBSA免疫原的制备方法包括以下步骤：

(1)将ITCBE和二甲基亚砜(DMSO)按照ITCBE的质量和二甲基亚砜的体积比为(8～12)mg：1mL混合，形成金属鳌合剂溶液；

(2)将氯化铬与HEPES缓冲液按照16.1mg：1mL的比例混合，形成Cr³⁺溶液；

(3)将所述步骤(1)中得到的金属鳌合剂溶液和所述步骤(2)中得到的Cr³⁺溶液按照体积比为1:1混合，调节混合液pH值至7.0，然后在23～27℃条件下振荡反应10～14h，形成Cr-ITCBE鳌合物半抗原；

(4)将BSA、EDC与PBS缓冲液混合搅拌得到混合液，BSA质量、EDC质量与PBS缓冲液的体积比为66mg：11.6mg：5mL，将所述混合液与乙二胺按照混合液体积和乙二胺质量比为5mL：7mg的比例混合，37℃振荡反应2h得反应液；反应液用PBS透析4d，得到活化的载体蛋白BSA；

(5)将所述活化的载体蛋白BSA和pH值为8.0的HEPES缓冲液混合，形成浓度为30mg/mL的载体蛋白溶液；

(6)将所述步骤(3)中得到的Cr-ITCBE鳌合物半抗原溶液和所述步骤(5)得到的载体蛋白溶液按照体积比为1：1的比例混合，调节pH值至9.0，23～27℃条件下振荡反应22～26h，将得到的反应液装入透析袋，先用蒸馏水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Cr-ITCBE-cBSA免疫原；

所述酶标Cr-ITCBE鳌合物半抗原的制备方法，包括以下步骤：

A.将异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)与二甲基亚砜(DMSO)混合形成金属鳌合剂溶液；

B.将氯化铬与HEPES缓冲液混合，形成Cr3+溶液；

C.将所述步骤A中得到的金属鳌合剂溶液和所述步骤B中得到的Cr3+溶液混合，调节混合液的pH值至7.0～7.2，得到的混合液振荡反应10～14h，形成Cr-ITCBE鳌合物半抗原；

D.将标记用酶与HEPES缓冲液混合，得到酶溶液；

E.将所述步骤C得到的Cr-ITCBE鳌合物半抗原溶液与所述步骤D中得到的酶溶液混合，调节混合物的pH值至8.8～9.2，再将混合液振荡反应22～26h，得到酶标Cr-ITCBE螯合物半抗原；

所述步骤A、B和D之间没有时间顺序的限制；

所述C和D之间没有时间顺序的限制。

2.权利要求1所述铬离子检测试剂盒在检测环境中铬离子的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a、将抗铬离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Cr-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板孔内，混合，孵育后用洗涤液洗涤；

b、向检测板中加入底物显色液，孵育，加入终止液混合，测定OD值；

c、根据所述步骤b得到的OD值与预定的标准曲线，得到待测样品中铬离子的浓度，所述标准曲线是铬离子浓度与OD值之间的线性关系曲线。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测板孔内抗铬离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Cr-ITCBE鳌合物半抗原溶液的体积比为1～2：1～2：1～2。