[发明专利]一种修复酵母染色体结构异常的方法

说明书

本发明涉及基因组工程领域，公开了一种修复酵母染色体结构异常的方法。本发明利用酵母高效的同源重组机制以及筛选标签，快速筛选在设计区域发生链交换的酵母染色体，实现染色体结构异常的序列与正常染色体序列的交换，从而达到大尺度高效修复酵母染色体结构变异的目的。

技术领域

本发明涉及基因组工程领域，具体涉及一种修复酵母染色体结构异常的方法。

背景技术

染色体结构异常是指染色体非正常的发生断裂、重组或互换后产生染色体畸变。染色体结构异常的类型可以分为DNA拷贝数变异、大片段插入、大片段复制、大片段翻转、染色体移位等。染色体结构异常广泛发生在绝大多数物种中，很多染色体结构异常与细胞衰老、染色体遗传性疾病、癌症等疾病密切相关。例如，猫叫综合症是人的第五号染色体部分缺失引起的遗传病，果蝇的缺刻翅也是由于一段染色体的缺失造成的；果蝇的棒眼现象是X染色体上的部分片段重复引起的；第九号染色体长臂的倒置会造成女性习惯性流产。染色体结构变异可能来自于遗传性的变异也可能是由于射线、化学试剂、温度等外部环境的诱导或者生物体内代谢失衡、细胞衰老凋亡等引起的病变性质的变异，还可能来自于分子生物学的操作比如基因组编辑和大尺度DNA的合成等。大多数的染色体结构变异对生物体是不利的，会引起细胞生长缺陷，严重的甚至会致死。

酵母是与人类活动关系最密切的微生物之一，比较基因组学的研究表明不同种属的酿酒酵母之间有大量的染色体结构变异，这些染色体的结构差异一方面导致了不同物种的区分，另一方面也使不同类型的酵母拥有不同的生长特性。比如有耐高温耐抑制剂的酿酒酵母，也有高产乙醇的工业酵母菌株。和其他物种相似，酵母的染色体结构变异绝大多数也是不利的，需要对其进行修复。现有的染色体修复技术涉及修复的DNA尺度都比较小，比如利用CRISR-Cas9技术可以较好的实现点突变的修复或者和同源重组技术相结合可以实现数Kb长度的DNA序列的修复，但外源长DNA片段的合成和较低的转化效率使得CRISPR-Cas9技术一般局限于数Kb长度DNA序列的改变，对于数百Kb长度的DNA无法有效修复。目前针对数百Kb长度的DNA修复技术鲜有报道。因此，需要开发一种高效准确的修复酵母染色体结构异常的技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种修复酵母染色体结构异常的方法，使得所述方法能够更加简便和快速的修复酵母异常染色体，并扩大DNA的修复尺度至数百Kb。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种修复酵母染色体结构异常的方法，包括：

步骤1、确认变异酵母的染色体结构异常区域；

步骤2、变异酵母染色体上，在与着丝粒最接近的染色体结构异常区域的近着丝粒端朝着丝粒方向延伸的区域插入筛选标签基因1；正常酵母染色体上，在与筛选标签基因1相对应的位置处朝着丝粒方向延伸的区域插入筛选标记标签2；所述筛选标签基因1与筛选标签基因2不同，所述正常酵母在其与变异酵母的染色体结构异常区域相对应区域上具有正常染色体；

步骤3、将不同交配型的变异酵母和正常酵母交配形成二倍体酵母，然后进行减数分裂获得四分体，对四分体进行拆分获得孢子；

步骤4、根据筛选标签基因1和筛选标签基因2分别设置对应的筛选标签培养基，将所述孢子分别接种到两种筛选标记培养基上，两种筛选培养基上均无法正常生长的孢子为已经修复的酵母。

由于借助CRISR-Cas9技术对异常染色体修复时存在DNA修复尺度较小，且比较繁琐的缺陷，本发明结合酵母高效的同源重组机制，通过筛选标记和减数分裂实现大尺度酵母染色体的高效修复。

为了方便理解本发明的技术思路，在图1所示的染色体修复示意图的基础上对本发明方法的原理进行阐述(在图1中，筛选标签1和2分别选择URA、LEU，简写为U和L，阴影部分表示染色体结构异常区域，交叉区域为同源重组链交换区域，即U和L之间的区域)：