[发明专利]用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒的荧光LAMP引物

说明书

技术领域

本发明属于鱼传染性造血器官坏死病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物。

背景技术

传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)是影响水产养殖业的一种重要的鱼类弹状病毒。IHNV属于粒外弹状病毒属(Novirhabddovirus)，是引发传染性造血器官坏死病的病原，主要感染鲑、鳟鱼类。该病毒广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的许多地区，属于急性、出血性、高致死性病毒病，可感染多种鱼类，引起淡、海水养殖的多种经济鱼类发生流行性病害，尤其是对鱼苗和幼鱼，能引起较高的死亡率，严重时均可达到90％以上。该病毒引起的鱼传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis,IHN)一旦暴发，将会给水产养殖业带来灾难性的损失，已被国际动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)列为必须申报的疫病，《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》(联合公告第2013号)列为二类传染病、寄生虫病。目前尚缺乏控制病毒病的有效药物和方法，随未经检疫的鱼苗远途运输，使病毒宿主范围和地理分布呈扩大态势。国际上普遍采取的策略是一旦发现该病，迅速进行病鱼隔离或扑杀，从而控制该病的大规模爆发。IHN是世界各国积极进行防制的鱼类疫病。目前，常用的病毒检测方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法以及聚合酶链反应(PCR)。细胞培养分离病毒法结果可靠，但检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，而且往往还需要其他方法进行后续检测，才能确定病毒种类。普通PCR技术的应用，提高了检测的特异性和灵敏度，缩短了检测时间，取得了一定的效果。Williams等(1999年)还报道了使用多重RT-PCR检测IPNV、IHNV和VHSV的研究，大大提高了多种病毒检测时的工作效率。但是普通PCR方法检测病毒，需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大。实时荧光RT-PCR技术的发展，使病毒检测技术得到了进一步提高，这种检测技术也被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中。实时荧光RT-PCR技术进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测，但荧光RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高。

综上所述，目前鱼传染性造血器官坏死病毒检测方法存在检测周期长，步骤繁琐，工作量较大，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物，旨在解决目前鱼传染性造血器官坏死病毒监测方法存在检测周期长，步骤繁琐，工作量较大，成本较高的问题。

本发明是这样实现的，一种用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物，所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：

按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载IHNV基因组序列，进行多序列比对，寻找IHNV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMP Designer设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测鱼传染性造血器官坏死病毒荧光LAMP引物的鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法，所述鱼传染性造血器官坏死病毒的检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit200说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL；最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；