[发明专利]用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水疱性口炎病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法。

背景技术

水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，具有新泽西型和印第安纳型两个抗原型，为人畜共患病。牛、马、猪为易感动物，双翅目昆虫(如蚊和白蛉)是主要虫媒。病畜的水疱液、水疱皮和淋巴结中病毒含量最多。其临床症状与口蹄疫、猪水疱病难以区分。近年来，针对VSV的研究已有多种实验室检测方法，如：病毒分离试验(VI)、血清中和试验(SN)、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(直接型、间接型、竞争型，ELISA)、逆转录聚合酶联合反应(RT-PCR)、实时荧光逆转录聚合酶联合反应(Real timeRT-PCR)、免疫色层分析测试片(Lateral flow devices,LFD)等方法在国际期刊上发表。根据世界动物卫生组织针对上述疾病在不同的适用对象中有不同的推荐检测方法，但纵观上述实验室检测方法，虽然具有各自的优点，但也有不同层面的不足或缺陷：VI检测周期长，不适用于快速鉴别诊断；ELISA法易出现假阳性，特异性不强；SN和VN法灵敏度不高；RT-PCR法需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大；Real time RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高；LFD法步骤繁琐，不适用于大规模的筛查。

综上所述，现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法，旨在解决现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐的问题。

本发明所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法，所述合成方法包括：

根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计荧光LAMP引物，采用HPLC方式进行纯化，并将合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，保存于-20℃。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-Bind Viral DNA/RNAKit说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL。，Bst DNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

步骤三，仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

进一步，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法的内引物FIP和BIP浓度为1.6μmol/L、外引物F3和B3浓度为0.2μmol/L、环引物LF和LB浓度为0.8μmol/L，反应温度为63℃。