[发明专利]一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合

权利要求书

1.用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：

上游引物Fp：5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’ ；

下游引物Rp: 5’- CCAGGTCCACTCGGTCtA -3’；该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性，并且倒数第一位碱基A为HLA-A*31系列等位基因所含有的特异性碱基；

探针probe1：5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’；小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基；

探针probe2: 5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’；小写字母a表示的碱基为能够区分HLA-A*31:01等位基因和其它HLA-A*31等位基因的特异性碱基；

其中FAM为6-carboxyfluorescein; VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；

该引物探针组合还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述内参基因为ACTB，相应设计的特异性引物和探针，作为内质控体系，其序列如下：

上游引物Actin-F: 5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’ ；

下游引物Actin-R: 5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’ ；

探针Actin-probe: 5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’ ；

其中，CY5为Cyanine dyes 5；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备针对HLA-A*31:01等位基因的检测试剂盒方面的用途。

4.一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，其特征在于：包括以下环节：

（1）获得抽提的待测样本基因组DNA；

（2）在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与权利要求1或2所述引物探针组合按照确定比例混合；

（3）通过Applied Biosystem 7500或者ViiA™ 7 Real-Time PCR System 进行实时荧光PCR检测，其中分别利用FAM、VIC和CY5通道进行多通道荧光信号采集；

（4）分析判断待测样本是否携带HLA-A*31:01等位基因。

5. 根据权利要求4所述的检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL 2×Premix Ex Taq，HLA-A*31:01特异性上游引物Fp: 125nM~250nM，下游引物Rp：125nM~250nM，HLA-A*31:01特异性探针probe1：10nM~20nM, probe2:20nM~40nM，以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F：125nM~250nM，下游引物Actin-R: 125nM~250nM，探针Actin-probe:50nM~100nM；然后加入待测样本基因组DNA 10ng~50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃ 5~10 sec，60℃ 34~40 sec，共计40个循环。

6.根据权利要求5所述的检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法，其特征在于：目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪96或者384孔板上加入同一孔中进行扩增，但用三个荧光通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，两条特异性探针必须同时扩增出具有设定荧光值的荧光曲线，则判定待测样本携带有HLA-A*31:01等位基因。