[发明专利]一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合

说明书

本发明提出一种检测HLA‑A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合，在使用高特异性MGB探针检测法的基础上，同时结合ARMS(扩增阻滞突变系统)的方法，使检测HLA‑A*31:01等位基因的方法更具特异性。本发明设计的高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合如下：上游引物Fp：5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’探针probe1：5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’FAM为6‑carboxyfluorescein；VIC为4,7,2‑trichloro‑7‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；此外，使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因的特异性引物、探针和内参基因的引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、灵敏度高、可实时监测反应等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑A*31:01等位基因的检测。

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因诊断领域，具体涉及一种检测HLA-A*31:01等位基因的方法。

背景技术

卡马西平(CBZ)是临床上治疗癫痫和外周神经痛的常用药物。然而,作为临床上最常见的容易诱发药疹反应的药物之一，卡马西平的使用也使患者面临一定的风险。这种药疹反应分为重度的药物不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)、中毒性皮肤坏死松解(TEN)以及药物反应伴随的嗜伊红血球过多和系统综合征(DRESS)和轻度的药物不良反应如轻微斑丘疹(MPE)。卡马西平所导致的药疹反应发生率在10％左右，其中重度药疹反应如SJS/TEN的发生率尽管比较低(1-35/万)，但致死率可高达30-50％。有研究表明，人类白细胞抗原(HLA)家族的等位基因HLA-A*31:01与卡马西平所导致的药疹反应密切相关。对欧洲人群的研究表明，HLA-A*31:01等位基因的存在会使患者发生药疹反应的风险增加5％～26％。而在日本人群中，发生药疹反应的患者携带HLA-A*31:01等位基因的频率远远高于正常人(60.7％vs 12.5％，P＝3.64×10^-15)^[1]。此外，有研究表明在中国汉族人群中HLA-A*31:01虽然与卡马西平导致的SJS/TEN没有相关性，但其与卡马西平用药导致的MPE/DRESS有密切的相关性(25.8vs 2.8％，P＝0.0021)^[2,3]。在中国汉族人群中，HLA-A*31:01等位基因的携带率高至7.1％。因此，在卡马西平用药之前，进行HLA-A*31:01等位基因的检测非常必要，对于HLA-A*31:01阳性患者应尽量避免使用卡马西平进行治疗。

HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，现已发现9000多个等位基因，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。