[发明专利]利用数字PCR检测大麦条纹花叶病毒的方法及其专用成套试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用数字PCR检测大麦条纹花叶病毒的方法及其专用成套试剂。

背景技术

大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)属于大麦条纹病毒属，该病毒所引起的大麦条纹花叶病是禾本科植物上一种重要的病毒性病害，曾给我国小麦生产造成巨大损失。大麦条纹花叶病毒的主要传播来源为种子，即使带毒率很低的种子，也会出现发病症状，而且每粒带毒种子产生后代种子都是带毒的。如又从病田留种，种子带毒率就会愈来愈高，再使用这类种子扩大种植，则带毒种子所到之处病害就蔓延开来。由于这种病害的症状表现在温度较低(12℃)时条纹不明显，并在小麦生长后期有些小麦品种有隐症现象，不易确定为条纹花叶病。考虑到大麦条纹花叶病毒的高度危害性，因此有必要开展该病毒的检测鉴定技术研究工作。

目前大麦条纹花叶病毒检测方法主要有生物学、血清学、病毒粒子观察及RT-PCR技术。生物学方法因操作繁琐，检测周期长，且需要隔离检疫温室等设施，难以应用于现场的快速检测。血清学方法中以酶联免疫法(ELISA)应用最广，ELISA虽然可以在短时间内检测大量样品，但该方法存在标准阳性对照较难获得，相对费用低的抗血清种类不全，检测灵敏度低及整个实验操作流程较复杂等因素的限制。RT-PCR技术相对于血清法不用制备抗体，而且省时又省力，已经用于BSMV的检测，但对种子中病毒浓度低的样品却不足以做出可靠的诊断。

数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poisson distribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测大麦条纹花叶病毒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测大麦条纹花叶病毒的成套试剂。

本发明所提供的检测大麦条纹花叶病毒的成套试剂，可由引物对X1和探针BSMV-p组成；所述引物对X1可由引物BSMV-f和引物BSMV-r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段可为如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述探针BSMV-p可为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。

上述成套试剂中，所述引物BSMV-f可为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套试剂中，所述引物BSMV-r可为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套试剂中，所述探针BSMV-p可为如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。

上文中，所述y2)、所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述成套试剂中，所述探针BSMV-p的末端可具有荧光标记。

上述成套试剂中，所述探针BSMV-p的末端具有荧光标记具体可为所述探针BSMV-p的5′末端具有FAM荧光标记和/或3′末端具有TAMRA荧光标记。

上述成套试剂中，所述引物BSMV-f、所述引物BSMV-r和所述探针BSMV-p的摩尔比具体可为2：2：1。

上述成套试剂中，所述引物BSMV-f、所述引物BSMV-r和所述探针BSMV-p的量具体可如下：0.5μmol所述引物BSMV-f、0.5μmol所述引物BSMV-r和0.25μmol所述探针BSMV-p。

上述成套试剂中所述引物对X1也属于本发明的保护范围。