[发明专利]鉴定药物分子的靶标蛋白质的方法

说明书

本发明涉及鉴定药物分子的靶标蛋白质的方法，包括制造包含细胞溶解物或来源于人体的细胞的混合物A的(a)步骤；制造混合有细胞溶解物或来源于人体的细胞和药物分子的混合物B的(b)步骤；使混合物A和B变成相同的特定温度的(c)步骤；在(c)步骤中获得的特定温度的混合物A及B中分别混合彼此不同波长的荧光物质，对存在于混合物A及B的溶液部分中的蛋白质分别标记彼此不同波长的荧光物质的(d)步骤；将(d)步骤中获得的混合物A及B混合而制造混合物C的(e)步骤；将混合物C进行电泳的(f)步骤；及对于因(f)步骤的电泳而在凝胶中出现的蛋白质点分析荧光波长，确认因(c)步骤而显示出热稳定性变化的蛋白质的(g)步骤。

技术领域

本发明涉及一种鉴定药物分子的靶标蛋白质的方法，具体而言，涉及利用双向凝胶电泳中基于热稳定性变化的荧光差异的靶标蛋白质的识别方法，更具体而言，涉及通过双向凝胶电泳的荧光差异分析当特定药物、优选地生理活性分子与其靶标蛋白质结合时表现出的蛋白质的热稳定性变化，从而识别(identification)成为特定药物的靶标的蛋白质的方法。

背景技术

低分子物质为了表现出其生理活性，需要与其生物体分子伴侣结合。这样的现象被称为靶标结合(target engagement)，在药物的发现和生化学研究中是重要的领域。通过形态特征筛选的传统性天然物质或中标化合物(hit compound)的靶标蛋白质由于大部分未知，因此为了确定生理活性低分子物质的活性机理需要识别靶标蛋白质，这对于新型治疗剂或生物医学科学领域的研究工具的发展是重要的。

最常用于识别靶标的方法有亲和色谱-拉下实验(Schenone等人,Nat.Chem.Biol.2013.,9,pp.232-240)。在生理活性化合物被锚定于琼脂糖珠后，细胞溶解物与珠一同被培养，与变形的珠结合的靶标蛋白质与未结合的其他蛋白质分离。化学蛋白质组学中最近的两种方法包括：(i)通过利用蛋白质类的酶活性的基于活性的蛋白质组表达谱，利用活性部位的共价键标记(Simon等人,Nat.Chem.Biol.2013.,9,pp.200-205)；(ii)通过利用非酶蛋白质的结合相互作用的基于亲和性的蛋白质组表达谱，利用基于光亲和性的共价键性交联(covalent cross-linking)(Pan等人,Nat.Prod.Rep.2015.8.24.,doi:10.1039/c5np00101c)。这样的方法虽然成功扩大了化学蛋白质组学的范围，但为了导入酶反应中所需的亲电子体、点击化学中的烷烃部分(moiety)、靶标蛋白质中用于共价键性交联的光亲和性官能团等功能部位(functional handles)，需要对原来的生理活性化合物施加化学变形。由此，通过考虑功能的变化的最小化、光亲和性官能团的最佳化、包括分子结构及大小在内的构象因素(conformational factors)等，一直进行着发展用于靶标识别的探针的努力。例如，韩国注册专利第10-1427328中，试图进行通过以共价键对生理活性分子标记包含可与蛋白质结合的特定光反应官能团和荧光物质标记用官能团的探针来鉴定靶标蛋白质。

然而，用于功能化的设计及合成在靶标识别中只能成为巨大的障碍。合成大量的类似物且探索它们的结构-活性关系需要相当多的努力。即使所合成的靶标识别探针能够原样保持生理活性，也无法避免化学变形的探针与细胞的蛋白质组的非特异性的相互作用。不仅由于复杂天然物质的整体的合成的限制、或者将它们从天然供给源提取充分的量的限制而难以进行化学变形，而且一点点的变形也可能使原本中标化合物所具有的生物学活性丧失。例如，对于称为苔藓抑素1(bryostatin 1)的化合物的情况而言，不仅因需要经过58步骤的合成步骤而难以合成(Keck等人,J.Am.Chem.Soc.133,744-747(2011))，而且由于其化学结构非常复杂(图7a)，在利用以往的靶标识别方法的情况下，难以制作发挥合适功能的探针。此外，对于大麦芽碱(hordenine)的情况而言，与苔藓抑素1相反，具有非常简单的结构(图13a)，是不能够进行用于标记探针的化学变化的代表性的天然生理活性低分子物质。因此，实际情况是，需要一种无需任何结构变化的非标记靶标识别方法。