[发明专利]利用水凝胶微笼捕获蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其包括（1）使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使混合液、油相物质在微流控芯片上混合，获得微液滴，微液滴内，超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基‑烯的点击化学反应形成水凝胶，得到微凝胶；（2）对微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集；（3）加入脱乳化剂以破坏微凝胶的油相外层并进行清洗。本发明可仅捕获错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维，从而进行针对性研究。同时，水凝胶的形成无需借助加热或紫外照射，在此过程中不会对蛋白质结构产生影响，使检测结果更准确。

技术领域

本发明涉及一种与神经退行性疾病产生有关的蛋白质例如β-淀粉样蛋白、tau蛋白、a-突触核蛋白等的捕获方法。该捕获方法可为准确分析和研究蛋白质的聚集情况从而为进一步开发这些疾病的治疗药物提供必要的条件。

背景技术

世界人口在不断的老龄化，据世界卫生组织统计，目前全球有3560万痴呆患者，到2030年这一数字将增加一倍，2050年这一数字将增加至三倍以上。痴呆类型包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病等神经退行性疾病。普遍认为大量错误折叠的蛋白质，如β-淀粉样蛋白(amyloid beta)、tau蛋白、a-突触核蛋白(α-synuclein)在细胞内聚集是神经退行性疾病产生的物质基础。因此在开发针对这些疾病的治疗药物的过程中，需要有一种简单易用的方法捕获这些蛋白，并实时监控这些物质对于蛋白质聚集的影响。

水凝胶是由交联的聚合物链形成的三维聚合物空间网状结构。它不溶于水但亲水性使其能够容纳大量的水。此外，可以通过调节聚合物浓度和前体的分子量来改变孔径。其内部多孔结构可以将药物分子包裹在聚合物网络内。此外，这种结构也可以作为细胞封装的支架：其纳米级孔径可以允许后续向细胞供应营养物，但同时防止较大物质如抗体或酶的渗透。此外，水凝胶的生物相容性使其能更好地模拟蛋白质折叠的自然环境。

水凝胶通常分为物理凝胶和化学凝胶两种。其中物理凝胶包括热可逆凝胶，其在常温下呈稳定的凝胶态，但加热后可转变为溶液。但是，其中温度的改变可能影响蛋白质反应速度，破坏蛋白质结构。而化学凝胶使用较多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基团的超支化聚丙三醇(hPG)和聚乙二醇(PEG)。通过将这些大分子单体与光引发剂一同暴露于紫外线下进行快速交联，或利用加热手段引发自由基进行聚合。综上，无论是利用加热或紫外线辐照的方法，均会影响蛋白质反应，从而使得检测结果不准确。此外，现有常规的物理凝胶和化学凝胶捕获方法捕获的不仅有错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维，也会捕获错误折叠程度低的小分子蛋白质和部分小尺寸单体，无法对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维进行针对性研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的蛋白质捕获方法，该方法对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维可进行针对性捕获，同时，该方法无需依赖加热或紫外线辐照从而可以避免对蛋白质反应造成影响，从而可以获得更准确的分析结果。

为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其包括如下步骤：

(1)使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使所述混合液、油相物质在所述微流控芯片上混合，获得微液滴，所述微液滴内，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基-烯的点击化学反应形成水凝胶，得到外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶；

(2)对所述微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集，得到外层为油相内层含有不同折叠程度的聚合蛋白的微凝胶；

(3)向经过步骤(2)的体系中加入脱乳化剂以破坏所述油相外层并进行清洗以除去所述微凝胶内小于所述微凝胶孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕获了蛋白的水凝胶微笼，所述捕获了蛋白的水凝胶微笼可用于后续的检测分析。