[发明专利]一种与猪源喹赛多作用相关的基因CyaR及制备方法和应用

权利要求书

1.一种猪源喹赛多作用相关基因CyaR，其特征在于，CyaR基因的全长cDNA序列有505bp，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因CyaR，其特征在于，所述CyaR基因编码一个80个氨基酸的小肽，氨基酸序列如下：

MGFTASPWLFCCDACCVRETKTTISTRSNVPSPQERDIPPGSSVSAPRHPRRWNIKKMRNALSENLLPGLGYTPDSQSLV。

3.根据权利要求1所述的基因CyaR，其特征在于：所述CyaR基因的启动子全长序列为SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的基因CyaR，其特征在于：从所述CyaR基因启动子起点至上游-148位具有最高的启动子活性，包含了核心启动子序列；在-148至-306位之间和-1301至-1845位之间含有转录负调控元件。

5.根据权利要求1所述的基因CyaR，其特征在于：所述CyaR基因的核苷酸序列包括cDNA序列的互补链及其对应的mRNA序列、DNA序列和人工合成序列。

6.权利要求1所述的基因CyaR的制备方法，其特征在于：所述CyaR基因全长cDNA是采用末端快速扩增法获得，步骤如下：

(1)3'RACE：以猪肝脏总RNA为模板，进行反转录反应，反转录引物3'RACE Adaptor为5'-AGCGTCTAGAGGTACCGIAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'；以上述反转录产物为模板进行第一轮PCR反应，所用的引物对为上游外侧特异性引物GSsP1 5'-GAACTTGCTTCCTGGTCTCG-3'和3'RACE Adaptor Primer 5'-AGCGTCTAGAGGTACCGAATTC-3'；取第一轮PCR反应产物的稀释液作为第二轮PCR反应的模板，所用的引物对为上游内侧特异性引物GSsP2 5'-ATCTTATGGATGAGCCCCTTC-3'和3'RACE Adaptor Primer 5'-AGCGTCTAGAGGTACCGAATTC-3'，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、克隆和测序，获得cDNA的3'端序列；

(2)5'RACE：以猪肝脏总RNA为模板，进行反转录反应，反转录引物为5'端磷酸化修饰的RT-P 5'-pAACATCGGAAGG-3'，采用RNase H分解RNA模版，再利用T4 RNA连接酶使第一链cDNA环化或形成首尾相连的连接物；以上述环化产物为模板进行第一轮PCR反应，所用的引物对为外侧特异性引物S1 5'-GGTTCGAGTAAGCCCATCTGT-3'和A1 5'-GTGTAGCCGAGACCAGGAAG-3'；取第一轮PCR反应产物的稀释液作为第二轮PCR反应的模板，所用的引物对为S2 5'-ATCTTATGGATGAGCCCCTTC-3'和A2 5'-CTCATCTTCTTTATGTTCCAGCG-3'，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、克隆和测序，获得cDNA的5'端序列；将获得的3'端及5'端碱基序列进行拼接即得到CyaR基因的全长cDNA序列。