[发明专利]长效G‑CSF缀合物的液体制剂

说明书

本申请是申请号为201180006430.9的中国专利申请的分案申请，原申请是2011年1月18日提交的PCT国际申请PCT/KR2011/000369于2012年7月18日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及用于确保长效G-CSF缀合物的长期储存稳定性的液体制剂，在所述缀合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段是共价连接的并且显示出相比于野生型延长的作用持续时间。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激骨髓干细胞和白细胞以使其分化和增殖的细胞因子。它是分子量范围为18,000至19,000Da、pI为6.1(5.5-6.1，取决于糖基化程度)的糖蛋白(Nomura等，EMBO J.5(5)：871-876，1986)。

重组DNA技术发现了G-CSF的分子和遗传特性(Clark和Kaman，Science，236：1229-1237，1987)。自从用分离自CHU-2和人膀胱癌5637细胞系的mRNA所构建的cDNA文库克隆人G-CSF基因以来(Nagata等，Nature，319：415-418，1986；Nagata等，EMBO J.，5(3)：575-581，1986；Souza等，Science，232：61-65，1986)，重组DNA技术就已允许从哺乳动物细胞和原核生物中生产G-CSF。此外，本发明人发现修饰的hG-CSF可以以在其N端不含甲硫氨酸残基的形式大量分泌到周质中，其中所述修饰的hG-CSF与野生型的不同之处在于其中至少一个氨基酸残基(特别是17位的半胱氨酸残基)被替换为不同的氨基酸残基(韩国专利No.10-356140)。

由于多肽易于因其稳定性低而变性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通过肾脏或肝脏，因此需要频繁地向患者施用蛋白质药物(包括作为药物有效成分的多肽)以维持期望的血液水平浓度和效价。但是，这种蛋白质药物的频繁施用引起患者疼痛，特别是在通过注射施用的情况下。

为了解决这些问题，进行了很多努力来改善蛋白质药物的血清稳定性并使血液中的药物在更长的时间内维持在高水平，从而使药物的药效最大化。为了在长效制剂中使用，必须将蛋白质药物配制成高稳定性的且其效价维持在足够高的水平而不引起患者免疫应答。

为了稳定蛋白质并防止酶促降解和被肾脏清除，通常使用具有高溶解度的聚合物(如聚乙二醇(PEG))来对蛋白质药物表面进行化学修饰。通过与靶蛋白的特定区域或多个区域结合，PEG使蛋白质稳定并防止水解，而不引起严重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering71：137-139，1991)。然而，尽管聚乙二醇化能够增强蛋白质稳定性，但其也存在问题，例如大大降低生理活性蛋白质的效价。另外，产量随着PEG分子量的增加而降低，这是由于蛋白质反应性的降低所致。

用于改善生理活性蛋白质的体内稳定性的一种替代性方法是通过基因重组技术将生理活性蛋白质的基因与编码具有高血清稳定性之蛋白质的基因连接，并且培养用该重组基因转染的细胞以生产融合蛋白。例如，融合蛋白可以这样制备：通过基因重组将白蛋白(已知的在增强蛋白质稳定性方面最有效的蛋白质)或其片段与目的生理活性蛋白质缀合(PCT公开No.WO 93/15199和WO 93/15200，欧洲专利公开No.413,622)。

另一种方法是使用免疫球蛋白。如美国专利No.5,045,312中所描述的，通过使用交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白缀合。该缀合物与未修饰的生长激素相比具有增强的活性。采用碳二亚胺或戊二醛作为交联剂。但是，与肽非特异性结合的这种低分子量交联剂不允许形成均一的缀合物，并且甚至在体内是有毒的。此外，该专利表明活性增加仅仅是由于与生长激素的化学偶联。该专利的方法不能保证不同种类的多肽药物的活性增强，因此该专利甚至没有认识到与蛋白质稳定性相关的因素，如持续时间、血液半衰期等。

最近提出的一种药物制剂是体内持续时间和稳定性均改善的长效蛋白质药物制剂。为了在长效药物制剂中使用，通过将生理活性多肽、非多肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接来制备蛋白质缀合物(韩国专利No.10-0567902和10-0725315)。