[发明专利]P‑Zn荧光探针、制备方法及在生物成像中的应用

说明书

技术领域

本发明属于有机分子分析检测技术领域，涉及一种新的有机分子用于特异性识别锌离子并用于细胞、切片及斑马鱼中锌离子成像。

背景技术

锌离子作为生物体系中稳定的d区元素，在蛋白质的结构、催化、转运及调控中扮演着重要的角色，同时也是大脑神经信号传递过程中必需的离子信号分子。当大脑中的锌离子的稳态被破坏时，例如阿尔兹海默症等的神经退行性疾病可能就会由此产生。而且早期的一些临床实验已经证明锌离子的螯合物可以抑制Aβ的沉积，且自由的锌离子会诱导淀粉样蛋白沉积。而淀粉样蛋白沉积又是阿尔兹海默症的一个明显标志。因此锌离子和阿尔兹海默症有密切的关系。然而，目前脑中锌离子行为的研究还有很多挑战，因此寻找一种有效的检测阿尔兹海默症中锌离子行为的方法，具有重要的意义。

分子荧光探针以其特有的高选择性以及高灵敏度，为生物体中的活性氧、pH、金属离子和其他的氧化应激小分子的检测提供了一种有效的方法。然而目前已有的检测探针大部分是单光子，它的激发往往需要更大的能量。双光子荧光探针近些年来逐渐变成了热点，因其原理是通过两个或两个以上的光子同时到达荧光团，且只发生在焦平面上，与共焦显微镜相比，双光子荧光探针检测方法减少了焦外激发和光损伤，增加了细胞活力，同时长波长可以保证最低限度的散射和更深的渗透性。对于较厚的样品，比如斑马鱼和鼠脑切片的成像，双光子荧光探针检测方法具有很大的优势。然而，现有技术中，双光子荧光探针检测方法仍然存在双光子吸收截面小、荧光量子产率低和选择性差等的缺点。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种荧光探针P-Zn，其具有高选择性、高荧光量子产率及高双光子吸收截面，通过结合特异性响应分子对锌离子(Zn²⁺)进行成像能实现对Zn²⁺的检测，具有高时空分辨率、高稳定性和高灵敏度以及低毒性的优点。

本发明提供了P-Zn荧光探针，其结构如式(a)所示：

本发明还提供了一种P-Zn荧光探针的合成方法，所述方法包括以下步骤：

在有机溶剂中，氢化钠、四乙基2,2'–联吡啶-5,5'-亚甲基二磷酸盐、4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛，进行反应，得到式(a)所示P-Zn荧光探针，反应过程如反应式(I)所示。

其中，所述氢化钠、四乙基2,2'–联吡啶-5,5'-亚甲基二磷酸盐、4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛的摩尔浓度比为5-8：1-1.2：1-3；优选地，为6：1：2。

其中，所述反应的温度为30℃-50℃；优选地，为32℃。

其中，所述反应的时间为10h-15h；优选地，为12h。

其中，所述有机溶剂选自THF、CH₂Cl₂、CH₃OH；优选地，为THF。

其中，所述P-Zn荧光探针为D-π-A-π-D构型(D表示电子给体，A表示电子受体)，为高双光子吸收截面的比率型荧光探针。

其中，在反应结束后，还可以包括以下步骤，对产物进行纯化：将装置冷却到室温，旋蒸除去THF，将旋蒸得到的产物加入水中，然后再用二氯甲烷萃取，再向萃取得到的有机相加入Na₂SO₄，旋蒸得到粗产物，过柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:20)即可得到纯物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述P-Zn荧光探针的合成方法包括以下步骤：将12mmol的氢化钠加入到50ml无水的THF中，然后再向上述溶液中缓慢加入2mmol四乙基2,2'–联吡啶-5,5'-亚甲基二磷酸盐，及4mmol 4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛。将反应搅拌12小时后，反应结束后将装置冷却到室温，旋蒸除去THF，将旋蒸得到的产物加入水中，然后再用二氯甲烷萃取，再向萃取得到的有机相加入Na₂SO₄，旋蒸得到粗产物，过柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:20)即可得到纯物质。

本发明还提供了一种如上所述方法制备得到的P-Zn荧光探针，所述P-Zn荧光探针为D-π-A-π-D构型(D表示电子给体，A表示电子受体)，为高双光子吸收截面的比率型荧光探针。

本发明还提供了如上所述P-Zn荧光探针在体外通过双光子荧光成像检测Zn²⁺中的应用。