[发明专利]一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)菌种划线培养：嗜酸乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；

2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养30～50小时；

3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，培养基装液体积占三角瓶容积的40％～60％，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养30～50小时；

4)菌种保存：将二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于MRS液体培养基与50％甘油溶液的混合溶液中，得菌泥混合液，再将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，得嗜酸乳杆菌菌泥冻存管，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，备用；

5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内嗜酸乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；

6)菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～2ml直接接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，基础培养基装液体积占三角瓶容积的40％～60％，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的40％～60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；

9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的60％～80％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始4小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.0±0.1，培养周期9～12小时，直至监测到菌液OD₆₀₀值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；

10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时方可准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm，离心结束后，收集转鼓内的菌泥；

11)冻干保护剂添加：菌泥收集完毕后，按照菌泥：冻干保护剂＝1:1～2的体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、混合均匀，分装到冻干机托盘；

12)冷冻干燥：将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，真空度0～1.0Pa，温度－25℃，持续冻干53～72小时；

13)冻干粉收集，粉碎、包装。

2.如权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤4)中MRS液体培养基与50％甘油溶液的混合溶液中MRS液体培养基与50％甘油溶液的体积比为1:1～1.5。

3.如权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤4)中混合溶液与离心前菌悬液的体积比为1:10。

4.如权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述基础培养基的制备方法为：酵母蛋白胨20.0～40.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、酵母浸出物5.0～8.0g/L、乙酸钠4.0～8.0g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、柠檬酸1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值5.60～6.20；按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至5.60～6.20，115℃下灭菌30min。