[发明专利]一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法。

背景技术

在人的肠道中存在着几百种、数百亿个细菌，在肠内构成菌丛。迄今为止，人们已知这些肠道细菌分三类：一类是能够合成某些维生素、对有害细菌的增殖有抑制作用、对免疫功能有刺激和促进的效果，这就是以双歧杆菌和乳杆菌为主的有益菌，这些细菌通过调整肠道生态系统可保持人体的健康，减少疾病，延缓衰老，因此被称为益生菌；另一类是在肠道内会构成腐败、产生有害或致癌物质的有害菌，如梭状芽胞杆菌、拟杆菌属和真细菌属等；另外还有一类既有有害作用，又有有益作用的细菌，如胨球菌。

嗜酸乳杆菌属乳杆菌科中的乳杆菌属，形态呈细长杆状，杆的末端呈圆形，细胞大小一般0.6～0.9×1.5～6.0μm，成单、成双或者2～3个呈短链排列，无鞭毛，不运动，革兰氏阳性厌氧或兼性厌氧无芽孢杆菌，天然地存在于人和动物的胃肠道、人的口腔、阴道及传统的发酵乳中。

嗜酸乳杆菌在人体整个胃肠道中，调节微生态环境，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物具有拮抗作用。在胃部它是个小型“消毒车间”，在大肠中，它也可以释放有益双歧杆菌等其他益生菌生长的物质，增加大肠内益生菌的数量、增强它们的生命力。嗜酸乳杆菌和双歧杆菌在肠道内数量庞大，相互扶助，通过维护整个胃肠道的微生态平衡，还可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，还可以减少胆固醇的吸收，并能降低辐射对人体的伤害。

基于嗜酸乳杆菌对人体具有很好的营养保健作用，越来越多的企业以嗜酸乳杆菌冻干粉为食品添加剂制备生物制品和健康食品，那么单位产品活菌数就直接影响产品的功效。因此，在冻干粉生产制备过程中提高活菌数就尤为重要。

发明内容

本发明提供一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，达到嗜酸乳杆菌增殖培养、冻干粉活菌数量大、菌体收率高的目的。

本发明采用的技术方案为：

一种嗜酸乳杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

1)菌种划线培养：嗜酸乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；

2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养30～50小时；

3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，培养基装液体积占三角瓶容积的40％～60％，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养30～50小时；

4)菌种保存：将二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于MRS液体培养基与50％甘油溶液的混合溶液中，得菌泥混合液，再将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，得嗜酸乳杆菌菌泥冻存管，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，备用；

5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内嗜酸乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；

6)菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～2ml直接接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，基础培养基装液体积占三角瓶容积的40％～60％，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的40％～60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；

9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的60％～80％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始4小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.0±0.1，培养周期9～12小时，直至监测到菌液OD₆₀₀值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；

10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时方可准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm，离心结束后，收集转鼓内的菌泥；