[发明专利]cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法

说明书

技术领域

本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。

背景技术

cfDNA，即循环肿瘤DNA，是体内循环肿瘤细胞(CTC)和死亡的肿瘤细胞在细胞代谢时留在血浆中的残留物。cfDNA高通量测序技术是液态活检的一种，它只需像化验肝肾功能那样采集静脉血，即可对全身的肿瘤基因信息进行精确测定，基于肿瘤基因信息，就可以指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断，甚至早期发现和早期诊断。然而，精确测序cfDNA存在两个巨大技术障碍：首先是血浆中的cfDNA含量极低，且多为小片段分子特点，导致提取较为困难，丢失量大，检测灵敏度较低，因此限制了其在临床上的应用。其次是由于cfDNA为高度片段化，目前市场上cfDNA建库的方法，如在双链DNA末端补平加A后再加接头进行扩增，会导致一些cfDNA无法补平加接头，造成了cfDNA的损耗，使一些基因突变位点无法被检测到，进一步限制了检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏性、低成本的cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于cfDNA建库的接头，所述接头包括单链接头A和双链接头B；

所述单链接头A的序列为SEQ ID NO.1，且3′端用生物素修饰，用于连接和标识变性后的单链cfDNA；

所述双链接头B包括接头B1和接头B2，所述接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，用于连接双链cfDNA。

一种用于cfDNA建库的引物组，所述引物组包括SEQ ID NO.4-6所示的序列，所述序列为SEQ ID NO.4的引物用于单链cfDNA的单向扩增；所述序列为SEQ ID NO.5-6的引物用于扩增文库分子以进行文库检测。

一种cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包括所述的接头和引物组。

一种cfDNA建库的方法，包括如下步骤：

(1)对cfDNA进行去磷酸化与变性，得单链cfDNA；

(2)连接单链cfDNA与3′端被修饰的单链接头A，得3′端被修饰的单链连接产物；

(3)单向扩增第一次连接产物，得双链cfDNA；

(4)连接双链cfDNA与双链接头B，得双链连接产物；

(5)除去双链连接产物中3′端被修饰的一条链；

(6)文库质检。

上述技术方案产生的有益效果在于：

本发明首先将得到的ctDNA变性使其由双链变成单链，然后通过单链连接酶连接接头，使得几乎所有的ctDNA都能被捕获，避免了ctDNA的损耗，从而提高了检测灵敏度。本发明提供的建库方法操作简单，测序结果稳定，测序成本低。

附图说明

图1是本发明的建库方法示意图；

图2-3是本发明的测序结果图。

具体实施方式

为进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过2个实施例来说明：

实施例1：

本发明提供了一种cfDNA建库试剂盒产品，在试剂盒中包括有：

用于连接和标识变性后的单链cfDNA的单链接头A，所述单链接头A的3′端用生物素修饰；

用于连接单链cfDNA和单链接头A的单链连接酶和用于单链连接酶的缓冲液；

用于连接双链cfDNA的双链接头B，所述双链接头B包括接头B1和接头B2；

用于连接双链cfDNA的双链接头B的T4DNA连接酶和用于T4DNA连接酶的缓冲液；

用于单向扩增单链cfDNA的引物CL9和用于扩增文库分子以进行文库检测的引物IS7和IS8：

其中，所述双连接头B由如下方法制得：

对如下体系进行PCR，95℃反应10S，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头B。反应体系如下：

所述试剂盒还包括如下试剂：

缓冲A液(50ml):

缓冲B液(50ml):

严谨性洗脱缓冲液(50ml):

49.5ml 灭菌蒸馏水

250ul20％(wt/vol)SDS

250ul20×SSC buffer；

终止液(100ul):

98ul 0.5M EDTA(PH8.0)

2ulTween20；