[发明专利]一种伪狂犬病毒JS-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用

说明书

本发明提供一种伪狂犬病毒JS‑2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用，以我国新出现的PRV变异株JS‑2012株为基础，利用loxp‑Cre酶系统，在JS‑2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS‑2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS‑2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种重要动物传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。一些重要的病毒基因，如gE、gI、gG和tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。

伪狂犬最早发生于美国，我国于20世纪60年代初在猪群中也出现了该病毒流行，至今PRV仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康，并造成了严重经济损失。PRV感染猪，除哺乳仔猪呈现高死亡外，其它猪都能耐过。但在耐过猪的外周神经细胞中，存在PRV的潜伏感染。潜伏感染的PRV在一定条件下能被激活，从而成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRV Bartha株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。国内多个研究组已证实，我国此次猪伪狂犬病的爆发是由于我国出现了伪狂犬病毒变异株导致的。与经典PRV毒株SC相比，伪狂犬病毒变异株毒力出现增强，Bartha疫苗对变异株不能完全保护。为了有效防控PRV变异株，需要深入研究病毒的遗传变异与毒力增强机制。

发明内容

本发明以我国新出现的PRV变异株JS-2012株为基础，利用loxp-Cre酶系统，在JS-2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS-2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS-2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。

1、通过同源重组方法，在伪狂犬病毒JS-2012株gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp

2、利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rJS2012-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游。

3、将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012。pBAC-JS2012转染细胞，可产生感染性病毒resJS-BAC，表明JS-2012株基因组克隆质粒pBAC-JS2012具有感染性。利用Cre酶，可删除resJS-BAC中的pBeloBAC11序列，获得resJS-ΔBAC。resJS-ΔBAC具有与亲本病毒JS-2012株相似的体外生长特性和小鼠毒力。