[发明专利]用于鉴定黑麂的特异性PCR引物和方法及其在鉴定黑麂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定黑麂的特异性PCR引物及使用所述特异性PCR引物鉴定黑麂的方法，以及它们在鉴定黑麂中的应用。

背景技术

黑麂(Muntiacus crinifrons)是一种特产于我国的鹿科动物，也被称为乌金麂、蓬头麂，分类地位上属哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)。黑麂是中国的特产动物，没有亚种分化，分布范围十分狭小，分布于中国安徽南部、浙江西部、江西东部和福建北部的山地地区。栖息于海拔为1000m左右的山地常绿阔叶林及常绿、落叶阔叶混交林和灌木丛。因野生数量极其稀少，黑麂被列入国家I级重点保护动物和世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录(易危级)。国际上，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)更将其列入了附录I物种保护名录，其国际间的交换和贸易受到严格控制。

在野生动物的保护及管理工作中，基于分类学的准确物种鉴定是首要的前提。物种鉴定的结果往往是森林公安、工商、边检等行政执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。传统的形态学分类方法一直是灵长类动物鉴定的常用方法，但形态学分类方法固有的一些缺陷也给物种鉴定工作带来了困难，比如表型可塑性和遗传可变性、生物性别和发育阶段限制等。尤其是近年来在黑麂物种的实际鉴定工作中发现，出于对其皮张及肉的价值攫取，往往送检的黑麂样品都是毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便等，均非完整个体且样品量较小，从形态学上几乎已无法识别。这反映出在现实工作中，单纯基于形态学特征的物种鉴定方法已难以满足黑麂保护工作的实际需求。

随着聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术在法医学鉴定中的不断应用，以DNA序列分析为代表的分子生物学技术在濒危野生动物物种鉴定中也得到了广泛的应用。

因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对黑麂物种的精确测定的特异性PCR引物是本发明亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对黑麂物种进行测定的局限性，或是以常规方法对粪便中DNA进行测定来确定物种的方法的耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定黑麂的特异性PCR引物和鉴定黑麂的方法，以及它们在鉴定黑麂中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于鉴定黑麂(Muntiacuscrinifrons)的特异性PCR引物，所述特异性PCR引物包括如SEQ ID No：1所示的引物1，以及如SEQ ID No：2所示的引物2。所述特异性引物可以对目标样品进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳的分离结果即有无产生目的扩增产物，来鉴定待检物种。

本发明还提供一种利用特异性PCR鉴定黑麂(Muntiacus crinifrons)的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用特异性PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自黑麂的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自黑麂的样品。

在本发明中，出现的1条条带中所含有的DNA片段的长度为370bp。

在本发明中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，以30μL的PCR扩增体系为基准，引物的浓度优选为0.25-0.5pmol/L，DNA模板的用量优选为45-55ng。其中，用于PCR扩增的DNA聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规DNA聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本发明在此不再详细赘述。

所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本发明中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为55-65℃，退火时间为25-40s。另外，对于PCR扩增中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均为本领域常规的设置，本发明在此不再详细赘述。

本发明还提供了一种根据上述特异性PCR引物或上述鉴定方法在鉴定黑麂(Muntiacus crinifrons)中的应用。