[发明专利]一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法

权利要求书

1.一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：

步骤1)具有良好水溶性的壳聚糖四氧化三铁磁珠的制备：0.82g三氯化铁在强烈搅拌下溶于40mL乙二醇中直至溶液变澄清，3.6g无水醋酸钠和0.5g壳聚糖，在连续搅拌条件下加入上述溶液，搅拌持续20min，反应结束后溶液转移到50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，反应釜放在200℃恒温箱里反应16h，反应结束，冷却到室温，磁分离，乙醇清洗三次，60℃恒温箱干燥5h，制得具有良好水溶性的壳聚糖四氧化三铁磁珠，产物密封放在4℃冰箱备用；

步骤2)真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁磁珠的制备：2mg合成的壳聚糖四氧化三铁磁珠超声溶解在1mL，5％的戊二醛溶液中，1mL，5μM的氨基修饰的真菌毒素适配体链的PBS溶液加入到壳聚糖四氧化三铁磁珠溶液中，室温孵育4h，加入牛血清蛋白溶液封闭磁性材料上未连接的活性位点，用2mL水和2mL Tris-HCl缓冲溶液清洗，最终分散在2mLTris-HCl缓冲溶液中，备用；

步骤3)金@DTNB@银核壳纳米棒的制备：首先采用金种子生长法合成金纳米棒，离心浓缩2倍去除过量的CTAB，重新分散在去离子水中，每10mL金纳米棒溶液加入20μL，10mM的DTNB乙醇溶液，室温下磁力搅拌2h，离心去除未连接的DTNB，重新分散到相同体积的去离子水中；2mL上述合成的金@DTNB纳米棒强烈搅拌下加入4mL，0.04mM的CTAB溶液中，混和均匀后依次加入150mL，0.1M的抗坏血酸，不同体积的10mM的硝酸银，250mL，0.1M的氢氧化钠，混合均匀；

步骤4)真菌毒素适配体互补链修饰的金@DTNB@银核壳纳米棒的制备：上述合成的金@DTNB@银核壳纳米棒，离心清洗两次，最终分散到2mL，PH＝7.4的PBS缓冲溶液中；用磷酸三氯乙酯(TCEP)的Tris-HCl溶液活化巯基修饰的真菌毒素适配体互补链上的巯基，将上述活化的适配体加入金@DTNB@银核壳纳米棒溶液中，室温下孵育12h，加入牛血清蛋白(BSA)溶液，封闭纳米棒上未被适配体连接的活性位点，最后离心分离，重新分散到相同体积的PBS缓冲溶液中，待用；

步骤5)表面增强拉曼检测体系的构建及标准曲线的建立：将上述步骤4)合成的真菌毒素适配体互补链修饰的金@DTNB@银核壳纳米棒溶液200μL，与壳聚糖四氧化三铁磁珠溶液100uL混合，室温下孵育8h，磁分离去除上清液，沉淀重新分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中，构建成真菌毒素检测的拉曼传感体系；在上述构建的体系中加入100μL不同浓度的真菌毒素，室温下孵育2h，相应的壳聚糖四氧化三铁磁珠表面的真菌毒素核酸适配体和目标分子识别，使原来与磁珠连接的真菌毒素适配体互补链修饰的金@DTNB@银核壳纳米棒从磁性纳米粒子表面脱落，通过磁分离，去除脱落的真菌毒素适配体互补链修饰的金@DTNB@银核壳纳米棒，将沉淀重悬浮在100μL的Tris-HCl缓冲溶液中，采用拉曼光谱仪进行扫描表征，此时组装体系的拉曼信号改变，从而建立组装体系拉曼信号强度和对应真菌毒素浓度间的标准曲线。

2.根据权利要求1所述的一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法，其特征在于，在合成的金纳米棒@DTNB外包覆银壳层，通过调整加入硝酸银的量，最终根据金@DTNB@银核壳纳米棒的拉曼信号的强度确定硝酸银加入量，当每6mL金纳米棒的CTAB溶液中加入30μL，10mM的硝酸银时获得最强的拉曼信号，制备的加入不同硝酸银量的金@DTNB@银核壳纳米棒增强基底，通过紫外荧光光谱和表面增强拉曼光谱进行表征。

3.根据权利要求1所述的一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法，其特征在于，合成的金@DTNB@银纳米增强基底，其银壳层厚度为2±0.2nm。

4.根据权利要求1所述的一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法，其特征在于，将具有大散射截面的拉曼信号分子DTNB镶嵌于金银壳层之间，DTNB具有明显的拉曼信号峰且没有荧光干扰，在银壳层的保护下，拉曼信号更加稳定。

5.根据权利要求1所述的一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素检测方法，其特征在于，将壳聚糖四氧化三铁磁珠连接真菌毒素适配体链，作为真菌毒素的富集材料。