[发明专利]液固双相发酵生产厚垣孢普可尼亚菌孢子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种液固双相发酵生产厚垣孢普可尼亚菌孢子的方法，属于微生物发酵技术应用领域。

背景技术

植物根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，是引起农作物减产的主要病害之一。防治根结线虫的方法，主要包括化学防治、物理防治、抗病品种筛选及生物防治。目前线虫防治主要以化学防治为主，但化学防治不但生产成本较高，且毒性大，易污染环境，对人畜健康造成威胁，而物理防治效果不显著，抗病品种筛选则周期过长，因此，安全、高效的生物防治成为近年来国内外研究植物线虫防治的热点。根结线虫生防资源主要包括食线虫真菌、细菌、放线菌等，其中厚垣孢普可尼亚菌是国内外研究最多的线虫生防真菌之一。

厚垣孢普可尼亚菌（Pochoniachlamydosporia）属于真菌界，子囊菌门，子囊菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌目，麦角菌科，普可尼亚属，是一种兼性寄生菌。研究表明，厚垣孢普可尼亚菌既可在土壤中腐生,又能寄生于多种致植物病的线虫的雌虫、胞囊、卵囊或虫卵内，对植物寄生线虫具有较大的生防潜力。此外，厚垣孢普可尼亚菌对植物不具有致病性，因此，其在植物寄生线虫的生防上有着巨大的开发应用前景。

目前，国内还没有公开的专利涉及液固双相发酵生产厚垣孢普可尼亚菌孢子，相关发酵研究也较少，且现有方法普遍存在孢子含量低，发酵周期长等问题。如张虹等利用草炭、麦粒、玉米粉等发酵厚垣孢普可尼亚菌，15天后，其孢子总产量最高60×10⁶个/g。邢丽娟以马铃薯块为主要基质发酵厚垣孢普可尼亚菌，3周后孢子总产量才达18.75×10⁴ /mL。苏莹珍等采用玉米-沙石培养基发酵培养菌株284，培养 3 周后，厚垣孢子产量达1.00×10⁶个/g。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液固双相发酵生产厚垣孢普可尼亚菌孢子的方法，旨在利用廉价原材料高产厚垣孢普可尼亚菌孢子，降低厚垣孢普可尼亚菌菌剂生产成本，缩短发酵周期，为建立规模化的发酵工艺提供参考依据。

为实现本发明目的，本发明提供了一种液固双相发酵生产厚垣孢普可尼亚菌孢子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a菌种活化：活化厚垣孢普可尼亚菌菌种，得到活化后的孢子悬液；

b摇瓶种子液制备：将活化后的孢子悬液按体积比8-10%的接种量接种于已灭菌的摇瓶液体发酵培养基中，进行摇瓶培养，得到摇瓶种子液；

c液体发酵：将摇瓶种子液按照体积比8-15%的接种量接种于已灭菌的发酵罐液体发酵培养基中，进行发酵培养，得到液体发酵产物；

d固体发酵产孢：将液体发酵产物按照质量比20-25%的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中，进行浅盘固体发酵，得到厚垣孢普可尼亚菌孢子。

上述方法中，步骤a中活化厚垣孢普科尼亚菌菌种方法为：将厚垣孢普可尼亚菌接种于PDA茄型瓶斜面上，28℃培养5-7天，用100 mL无菌生理盐水反复冲洗活化好的菌株斜面，得到活化后的孢子悬液；

步骤b中摇瓶培养条件：温度25-28℃，摇床转速100-120 r/min，发酵时间1-2天；

步骤c中发酵罐液体发酵条件：装料系数0.4-0.6、罐压0.06-0.08Mpa，温度25-28℃， 0-24h通气量为1-2vvm、转速为100-120 r/min，24 h后通气量为1.5-2.5vvm、转速为130-150 r/min，发酵时间3-3.5天；

步骤d中浅盘固体发酵方法：在无菌操作台上，用无菌不锈钢盘分装已灭菌的固体发酵培养基1.5Kg/盘，同时接入步骤c中所得的液体发酵产物并混匀，然后将接种后固体发酵培养基置于固体培养箱中，培养过程中通2 L/min无菌空气，培养温度25-28℃，湿度控制在85%-95%，在培养过程中每隔2-3天翻动一次培养基，发酵时间7-10天。

本发明还提供了一种液体发酵培养基，所述液体发酵培养基的配方为：蔗糖10-40 g/L、蛋白胨0.5-2.5 g/L、NaNO₃ 0.5-2.5 g/L、KH₂PO₄ 0.2-1.2 g/L、K₂HPO₄ 0.2-1.2 g/L、MgSO₄•7H₂O 0.25-3g/L、FeSO₄•7H₂O 0.01-0.05 g/L、初始pH 5-8。