[发明专利]一种利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法

权利要求书

1.一种固定生物标识物的方法,其特征在于：包括如下步骤：

(1)将载体的表面先用生物素化PEG修饰；

(2)向所述的载体上加入亲和素，生物素与亲和素之间会发生连接；

(3)再向所述的载体上加入生物素标记的连接物1，生物素与亲和素之间发生连接，所述的连接物1被固定到所述的载体上；

(4)再加入连接物2，与所述的连接物1结合；

(5)加入生物标识物，生物标识物会与所述的连接物2发生连接，所述的连接物2作为诱饵捕获生物标识物；

(6)再加入与生物标识物反应的连接物3，最后加入荧光标记的检测分子与所述的连接物3连接，依靠生物标识物与连接物间特异性反应将生物标识物固定在所述在载体上，形成一种“夹心”的单个生物标识物检测模式。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物标识物为DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、细胞、细菌和病毒中的一种；所述连接物1为探针或二抗；所述的连接物2为探针或单抗；所述的连接物3为探针或多抗；所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针或荧光标记的二抗。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的生物标识物为DNA、RNA时，所述连接物1为探针，所述的连接物2为探针，所述的连接物3为探针，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针；所述的生物标识物为蛋白质、细胞、细菌或病毒时，所述连接物1为二抗，所述的连接物2为单抗，所述的连接物3为多抗，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的二抗。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的亲和素为链霉亲和素。

5.根据权利要求1～4中任一所述的方法，其特征在于：所述的生物标识物为猪圆环病毒的PCV2cap蛋白时，所述的连接物1为羊抗鼠二抗，所述的连接物2为鼠源单抗，所述的连接物3为兔源多抗，所述荧光标记的检测分子为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的载体为透明载体，作为一种优选技术方案，所述的载体为由石英玻片制成的样品小皿，所述的样品小皿内设有封闭的加样通道和用于向加样通道加样的加样孔。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述样品小皿的详细制备过程为：

a、在载玻片上钻多个孔作为加样孔并用去离子水反复清洗；

b、用体积比1:1的丙酮/酒精溶液超声清洗载玻片和盖玻片后再用去离子水漂洗干净；

c、用1mol/L的氢氧化钾溶液超声清洗载玻片和盖玻片后再用去离子水漂洗干净并烘干；

d、将所述的载玻片和盖玻片置于体积比为125:5:1的甲醇/无水乙酸/氨基硅烷偶联剂混合液中超声后静置反应；然后置于甲醇中超声后静置反应；再用去离子水漂洗干净并烘干；

e、取biotin-PEG和mPEG溶于0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液中并去除气泡得到PEG化试剂；

f、将盖玻片架平放置后，在其上中间位置滴加PEG化试剂液滴，将载玻片对正靠近液滴，载玻片和盖玻片会在液体张力的作用下自动吸引在一起；

g、将吸附在一起的载玻片和盖玻片孵育过夜后在去离子水流中将载玻片和盖玻片冲洗干净并烘干；

h、间隔并列粘贴多段双面胶带于载玻片上，在载玻片上垂直分成多个通道凹槽，将盖玻片正对通道凹槽黏在双面胶带上并压紧胶带，使得相邻通道凹槽之间互不贯通；用环氧树脂密封所述通道凹槽的两端形成封闭的加样通道，所述的孔作为加样孔分别设在所述加样通道的两端用于向加样通道内加样。

8.采用权利要求1～7中任一所述的方法制备的固定有生物标识物的载体。

9.权利要求8所述的固定有生物标识物的载体在利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物中的应用，其特征在于：利用全内反射荧光显微镜观察所述载体表面的荧光分子，通过采集荧光分子信号准确检测固定在所述载体上的生物标识物数目。

10.一种利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法，其特征在于：采用权利要求1～7中任一所述的方法将生物标识物固定到所述的载体上，利用全内反射荧光显微镜观察载体表面的荧光分子，通过采集荧光分子信号准确检测固定在载体上的生物标识物数目。