[发明专利]一种利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种利用基于全内反射荧光倒置显微镜检测单个生物标识物的方法。

背景技术

许多由病原微生物引发的疾病在当今世界范围内广泛发生与传播，严重危害到人类和动植物的健康，影响人类的生活品质。了解病原微生物的属性，对于疾病的预防和治疗是必不可少的环节。目前检测病原的方法有很多，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫印迹试验(Western Blot)以及聚合酶链式反应(PCR)等，但这些方法或多或少都存在一些问题，例如操作复杂、成本高、灵敏度低等缺点。生物体组织或者细胞内微量的病原使用常规方法难以检测出来，这就造成了对患病动物无法确定最佳的治疗手段，甚至会错过最佳治疗时机，导致病症加重。因此，高效灵敏地检测病原对于疾病防控与治疗至关重要。

全内反射(total internal reflection)是一种光学现象。光线从折射率较高的光密介质(如玻璃，折射率1.52)进入折射率较低的光疏介质(如液体溶液，折射率1.33～1.38)，入射角为θ1，折射角为θ2，当存在n1sinθ1＝n2sinθ2时，部分入射光线发生折射，部分发生反射。当入射角θ1大于或者等于临界角θc时，θ1≥θc，此时光线不再透射进介质2，发生了全反射。

全内反射发生时，会产生一种具有特殊性质的隐失波，这种隐失波的强度在样品界面水相中沿垂直界面的Z轴呈指数衰减，因而利用这种荧光激发方式只能够激发固定在盖玻片表面100nm范围内的荧光分子，游离于溶液中的荧光分子不会被激发光激发，所以采集到光信号背景噪音比较低。使用全内反射激发方式得到的图像背景很低，具有足够高的信噪比，可以分辨出单个分子的荧光信号。因此，使用全内反射荧光显微镜可以对病原的单个生物标识物进行观察，具有极高的检测灵敏度。本发明中，我们公开了一种使用基于全内反射的荧光倒置显微镜检测生物标识物的方法，此方法操作简单，成本低，而且具有很高的检测灵敏度，对于病原检测和疾病诊疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定生物标识物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种利用基于全内反射荧光倒置显微镜检测单个生物标识物的方法。该方法采用荧光标记的检测分子与生物标识物间接地连接，通过全内反射荧光显微镜采集荧光标记的检测分子的荧光点数目，达到检测生物标识物的目的。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种固定生物标识物的方法,包括如下步骤：

(1)将载体的表面先用生物素化PEG修饰；

(2)向所述的载体上加入亲和素，生物素与亲和素之间会发生连接；

(3)再向所述的载体上加入生物素标记的连接物1，生物素与亲和素之间发生连接，所述的连接物1被固定到所述的载体上；

(4)再加入连接物2，与所述的连接物1结合；

(5)加入生物标识物，生物标识物会与所述的连接物2发生连接，所述的连接物2作为诱饵捕获生物标识物；

(6)再加入与生物标识物反应的连接物3，最后加入荧光标记的检测分子与所述的连接物3连接，依靠生物标识物与连接物间特异性反应将生物标识物固定在所述在载体上，形成一种“夹心”的单个生物标识物检测模式。

所述生物标识物为DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、细胞、细菌和病毒中的一种；所述连接物1为探针或二抗；所述的连接物2为探针或单抗；所述的连接物3为探针或多抗；所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针或荧光标记的二抗。

所述的生物标识物为DNA、RNA时，所述连接物1为探针，所述的连接物2为探针，所述的连接物3为探针，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针；所述的生物标识物为蛋白质、细胞、细菌或病毒时，所述连接物1为二抗，所述的连接物2为单抗，所述的连接物3为多抗，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的二抗。

所述的亲和素为链霉亲和素。

所述的生物标识物可以为蛋白，例如猪圆环病毒的PCV2cap蛋白(即抗原PCV2)。作为一种技术方案，所述的生物标识物为猪圆环病毒的PCV2cap蛋白时，所述的连接物1为羊抗鼠二抗，所述的连接物2为鼠源单抗，所述的连接物3为兔源多抗，所述荧光标记的检测分子为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗。

所述的载体为透明载体，作为一种优选技术方案，所述的载体为由石英玻片制成的样品小皿，所述的样品小皿内设有封闭的加样通道和用于向加样通道加样的加样孔。

上述样品小皿的详细制备过程为：