[发明专利]一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法

权利要求书

1.一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其包括的步骤为：

A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；

B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；

C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；

D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；

E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；

F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和

G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。

2.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。

3.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体序列的恒定区设计的引物。

4.如权利要求1或3所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物如SEQ ID NO:1和2所示。

5.如权利要求4所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第二步PCR的引物如SEQ ID NO:3、4和5所示。

6.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤E)中DNA文库的构建步骤包括：

a)PCR扩增获得的所述纳米抗体DNA片段的末端修复；

b)步骤a)中所述修复的纳米抗体DNA片段与Adaptor连接；

c)步骤b)中连接adaptor后的所述DNA片段的选择性回收；和

d)以步骤c)中所述DNA片段为模板进行PCR扩增，并纯化所述PCR产物。

7.如权利要求6所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤E)中PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO：6、7和8所示。

8.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤G)中表达载体为pET28a。

9.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物选自骆驼属或人。

10.如权利要求9所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物为羊驼或者骆驼。