[发明专利]一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗体技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。

背景技术

抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条重链(H链)和2条轻链(L链)构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗(heavy-chain antibody，hcAb)，IgG2和IgG3亚型具有完全的抗原结合能力。这些重链抗体(HcAbs)在羊驼属(Lama)血清中约占总Ig的50％，在骆驼属(Camelus)血清中约占总Ig的75％。重链抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。另外，重链抗体还具有易表达，可溶性好，稳定性强，免疫原性弱，穿透性好等优点。已有的研究表明该重链抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、医疗领域、药物开发等领域有广阔的应用前景。

目前获取纳米抗体最常用的方法是噬菌体抗体库筛选技术，该技术采用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示，将纳米抗体片段表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性纳米抗体。该技术构建的抗体库称为全套抗体库，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。

噬菌体抗体库按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。噬菌体抗体库建库的主要步骤包括：首先分离外周血单个核细胞(PBMC)，提取细胞的RNA，经过RT-PCR扩增可变区基因，之后酶切插入噬菌体质粒(phagemid)，转化感受态细胞并扩大培养，获取噬菌体抗体库；之后采用合适的筛选步骤筛选特异性的抗体分子。抗体库的筛选方法主要有两类：一是将抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。

虽然噬菌体抗体库技术具有一些明显的优点，如方法简单易行，可通过发酵生产来大量制备；筛选容量增大，可在数周内筛选100万～1亿个克隆，可获得高亲和力的抗体；直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，可以获得完全人源化的抗体；模拟体内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。然而，噬菌体抗体库技术也存在一些问题，如难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降等都需要改进。

发明内容

基于获取纳米抗体最常用噬菌体抗体库筛选技术的耗时长，筛选合适抗体困难，难于筛选到高亲和力的最佳抗体分子，难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降的缺点，本发明提供了一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。

所采用的技术方案如下：

一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其步骤包括：

A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；

B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；

C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；

D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；

E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；

F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和

G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。

其中，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。

所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体恒定区序列设计的引物。

进一步的，两步法PCR的第一步PCR的引物如SEQ ID NO:1和2所示。所述步骤D)中，两步法PCR的第二步PCR的引物如SEQ ID NO:3、4和5所示。