[发明专利]检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法

权利要求书

1.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：

LAMP引物组合物由以下4条引物组成：

上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’；

25μL反应体系由以下成分组成：8 U/μL Bst DNA聚合酶0.5 μL、10×ThermoPolBuffer 2.5 μL、20 μM FIP 2.0 μL、20 μM FIB 2.0 μL、10 μM F3 0.5 μL、10 μM B3 0.5μL、25 mM MgCl₂ 4.0 μL、10 mM dNTPs 2.5 μL、5 M甜菜碱3.0 μL、3.75 mM羟基萘酚蓝1 μL、DNA模板1 μL，ddH₂O补足至25 μL；

利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，判定显示检测到山核桃干腐病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，判定显示样品无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未达检测的最低检测浓度；

方法二、取5μL扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到山核桃干腐病病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未达最低检测浓度。

2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min； 80℃灭活10min。

3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：

所述方法一、方法二中的最低检测浓度均为0.01 ng/μL。