[发明专利]检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法

说明书

本发明公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法和引物，LAMP引物组合物由4条引物组成。本发明还同时公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，除了包含上述LAMP引物组合物之外，还包括10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。本发明以β‑tubulin基因保守区片段序列设计LAMP引物，并进行快速分子检测技术体系和反应条件的优化，能对山核桃干腐病病菌进行LAMP检测，反应过程简便、检测周期短、特异性强、灵敏度高，可用肉眼观察检测结果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环介导等温扩增(LAMP)技术检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警技术领域。

背景技术

山核桃干腐病从2002年开始在临安、淳安、桐庐等山核桃产区普遍发生，受害面积逐步扩大，目前发生面积达27万亩，发生严重的整株枯死，轻的影响生长造成落果，据测算发生区平均产量减少24％左右，成为山核桃产业发展的瓶颈。有不同的研究报道或推测不同的因素和山核桃干腐病的发生有关。本实验室研究发现茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，即，山核桃干腐病菌(B dothidea)是引起山核桃干腐病的主要病原，且山核桃的发生严重程度主要与其生物学和流行特性有关。连续5年的观察发现，该病原菌以菌丝体在病组织内越冬，第二年春季气温上升病菌开始活跃，在树皮表面形成子实体并释放孢子，进行再侵染。孢子借风雨传播，侵入树皮细胞或树体伤口后表现明显的“潜伏侵染”特性，从3月下旬开始到11月都有不同程度的病害发生。4月中旬至6月中旬气温在25℃—30℃是孢子释放侵染的高峰期的高峰，7～8月气温30℃以上的高温天气不利于病菌的发展，秋季气温下降至30℃以下又会产生病菌的发展(未报道资料)。因为该病菌长期处于“潜伏侵染”状态，一旦等其潜伏的共生状态转变到腐生致病状态，形成肉眼可见的病斑，再采取防治措施，已经为时已晚。防治效果会很不理想。所以，要高效地防治山核桃干腐病，在其潜伏的共生状态期的早期快速检测就非常重要。

随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测山核桃干腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。但是，引物的设计不容易获得。

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩增，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害；长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准即可，达到快速检测的目的。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有β微管蛋白基因，后逐步发展起来成为分子标记，其优点在于：具有高拷贝数；同时包含保持与变异序列；能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的β-tublin总的说来是相对保守的，但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较，而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵敏。

发明内容