[发明专利]一种猪松弛素的提取纯化方法

权利要求书

1.一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：

(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；

(2)阳离子交换层析；

(3)疏水层析；

(4)冷冻干燥；

其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品；

将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取时所述丙酮与猪卵巢的量的比为1-5L/kg；

提取液加入丙酮后低温处理时所述丙酮的体积为所述提取液的1-10倍。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的过程包括：

(a)将冰冻的猪卵巢处理为小块，加入0-10℃的盐酸，0-10℃下搅拌抽提1-5小时，再加入0-10℃的丙酮，0-10℃下搅拌抽提2-10小时，静置5小时以上，优选10小时；

(b)将步骤(a)所得抽提溶液0-10℃下离心；

(c)取步骤(b)所得上清液加入-10℃--40℃的丙酮，搅拌后置0-10℃低温操作间10小时以上，优选为24小时；

(d)将步骤(c)所得底部沉淀0-10℃下离心，然后沉淀经丙酮脱水后干燥即得所述松弛素粗品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述猪卵巢经绞碎处理；

优选地，所述盐酸与猪卵巢的量的比为0.1-1L/kg，优选为0.3-0.5L/kg；

优选地，所述丙酮与猪卵巢的量的比为2-2.5L/kg；

优选地，所述盐酸的浓度为0.5-5mol/L，优选为1.5mol/L；

优选地，所述搅拌抽提的温度为4-8℃。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述离心的转速为3000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟；

优选地，步骤(c)中所述丙酮的体积为所述上清液的4倍；

优选地，所述搅拌的时间为2分钟以上，优选为5分钟；

优选地，步骤(d)中所述离心的转速为4000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟。

5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)的过程包括：将步骤(1)所得松弛素粗品溶解于平衡缓冲液中，离心后取上清液过滤，调节过滤液pH值和电导率值与平衡缓冲液一致，然后将过滤液上层析柱；上样完毕后，用洗涤缓冲液冲洗层析柱，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为NH₄Ac，pH为4-6.5，优选为5.0-6.0；

优选地，所述平衡缓冲液为0.03-0.08mol/L的NH₄Ac，优选为0.05mol/L的NH₄Ac；

优选地，所述松弛素粗品与平衡缓冲液的比例为1:10-20g/mL；

优选地，所述洗涤缓冲液为0.03-0.08mol/L NH₄Ac与0.01-0.05mol/LNaCl的混合液，优选为0.05mol/L NH₄Ac与0.01-0.05mol/L NaCl的混合液；

优选地，所述洗脱液为0.03-0.08mol/L NH₄Ac与0.1-0.3mol/L NaCl的混合液，优选为0.05mol/L NH₄Ac与0.1-0.3mol/L NaCl的混合液；

优选地，所述层析柱的层析介质为CM-Sepharose FF凝胶。

7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)的过程包括：向步骤(2)收集得洗脱液中加入平衡缓冲液，离心，取上清液过滤，然后将过滤液上层析柱；上样完毕后，用洗涤缓冲液冲洗层析柱，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。