[发明专利]一种猪松弛素的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种猪松弛素的提取纯化方法，更具体地涉及一种从猪卵巢中采用丙酮梯度抽提，离子交换层析和疏水层析技术分离纯化猪松弛素的方法。

背景技术

松弛素是一种对母畜分娩前产道有松弛作用的多肽类激素，主要产生于哺乳动物妊娠期间卵巢中的黄体，其最初作为一种与哺乳动物生殖活动有关的多肽激素被发现。随着研究的深入，发现松弛素具有更广泛的生物学功能：如抑制胶原的形成与促进胶原酶合成，从而促进胶原的降解，在分娩时软化生殖道组织，抑制子宫收缩，促进骨盆韧带软化，刺激乳腺生长与分化；能够刺激多种器官与组织的血管扩张，抑制血小板凝集；刺激胰岛细胞分泌胰岛素，调节体内血糖；促进溃疡组织愈合；影响垂体激素分泌。

由此可见，松弛素具有复杂的生物学作用和广阔的医学应用前景。目前国外已有报道，Connetics公司已将松弛素用于全身性硬皮病的治疗当中，并已完成了Ⅰ期、Ⅱ期临床试验。而国内在此方面的研究甚少。

松弛素已从许多种生物中被提纯，包括猪、鼠、马、鲨、虎、大鼠、角鲨及人类。然而，如何获得高纯度的松弛素仍然是一个值得研究的课题。松弛素在动物体内含量低，且稳定性差，提取纯化难度高。高纯度松弛素需从卵巢组织中抽提出含有松弛素的粗品蛋白，再去除几乎所有的杂蛋白，其纯化工艺存在许多难点。如J.Doczi采用盐酸丙酮抽提，氯化锌盐析的方法，得到的松弛素纯度不高，并且高浓度的氯化锌对松弛素活性也有影响(O.D.Sherwood，Isolation and Characterization of Porcine and Rat Relaxin，Advances in Experimental Medicine and Biology pp 115-138，1982,DOL 10.1007/978-1-4613-3368-55)。C.David Sherwood等人采用盐酸丙酮抽提、分子筛层析和离子交换层析的方法，得到了较高纯度的松弛素(C.D.SHERWOOD et al,Purification and characterization ofporcine relaxin,Chemical Abstracts Band 80,Nr.13,1.April 1974,Columbus,Ohio,USA)。但该法在分子筛层析过程中损失很大，并且不利于大规模生产；在离子交换洗脱后，存在相似电荷特性的杂蛋白，影响最终产品的纯度。后来采用的阳离子交换层析和阴离子交换层析结合的技术虽能制备纯度合适的样品，但是由于阴离子交换层析在吸附和洗脱时采用的高pH条件，会严重破坏松弛素的生物活性。

另外CN 102603888A公开了一种采用毕赤酵母菌制备人类松弛素-2的方法，其中从发酵液提取纯化人类松弛素-2需要反复进行数次微孔滤膜过滤，且需要3次色谱柱分离纯化操作，耗时较长。CN 103788207A公开了一种从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法，该方法包括将发酵液离心后过截流分子量3000的醋酸纤维素超滤膜过滤，依次上SephadexG-50柱和SynchropakRP-PC18反相HPLC层析柱进行层析纯化，然后通过低温旋蒸浓缩，冷冻干燥，得纯化的人类松弛素-2。该方法原料昂贵，不易获得，且难以保存松弛素结构和生物活性的完整。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点，本发明的目的在于提供一种猪松弛素的提取纯化方法。本发明的方法制备的松弛素不仅收率高、纯度高、产量大，而且所得松弛素的结构和生物活性保存完整。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：

(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；

(2)阳离子交换层析；

(3)疏水层析；

(4)冷冻干燥；

其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品；低温例如可以为-10℃--40℃，例如-15℃、-19℃、-21℃、-26℃、-30℃、-35℃、-38℃等；

将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取时所述丙酮与猪卵巢的量的比为1-5L/kg，例如为1.3L/kg、1.8L/kg、2.5L/kg、2.9L/kg、3.3L/kg、3.7L/kg、4.1L/kg、4.6L/kg、4.9L/kg等；