[发明专利]一种TTLL12基因新转录本的鉴定引物及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种TTLL12基因新转录本的鉴定引物及其方法。

背景技术

微管蛋白酪氨酸连接酶样(Tubulin Tyrosine Ligase Like protein,TTLL)蛋白家族有14个成员，均含有TTL结构域，具有微管蛋白的翻译后修饰功能，如酪氨酸化修饰、甘氨酸化修饰(TTLL3、TTLL8、TTLL10)、谷氨酰胺化修饰(TTLL1、TTLL2、TTLL4、TTLL5、TTLL6、TTLL7、TTLL9、TTLL11、TTLL13)，进而影响微管的稳定性。在多种癌细胞中，TTLL蛋白对微管蛋白的修饰功能会被抑制，如在肺癌及乳腺癌细胞中，只能发现丰度很低的谷氨酰胺化微管蛋白。

TTLL12是一个十分特别的TTLL蛋白家族成员，它的TTL结构域与其他成员有明显的差异：特异性TTL结构域的N端序列缺少结合ATP和镁离子的12个核苷酸序列，还缺少7个保守的结构域中的3个，国内外的最新的研究都表明它的TTL结构域不具备微管蛋白修饰酶的催化功能，其影响微管蛋白修饰的机制还不明确。

一个基因在不同的发育阶段、分化细胞和生理状态下，可以通过不同的剪切方式得到不同的mRNA和翻译产物。每个转录本可能发挥着独特的功能。因此，研究和开发基因的新转录本的方法对该基因功能的分析具有重要的作用。

CLOCK基因存在2个不同的转录本，有研究发现，CLOCK基因与不孕不育、肥胖及脂肪代谢异常、糖尿病、肿瘤、高血压疾病、急性心肌梗塞(AMI)等病理过程高度相关而且其对沙门氏菌感染抗性中发挥着重要作用。专利文献CN103436607B公开了鸡CLOCK基因不同转录本的扩增方法及其引物，该扩增方法是对每个转录本序列，设计了转录本特异引物，通过反转录PCR技术可以扩增出特定的转录本，对不同转录本功能的分析研究奠定基础，更有利于CLOCK基因功能的研究，提高CLOCK基因引起的疾病的诊断准确性。

例如，为了更一步了解AML1基因的功能，许艾宁等发表了题目为“AML1基因的一种新转录的鉴定与克隆”。刘世饶等发表了一篇题目为“一种新的人CNA1基因转录本的克隆和功能鉴定”的论文，进一步的分析CNA1基因的功能。

然而，目前，尚未见有对TTLL12基因的新转录本的报道，不利于TTLL12基因功能的研究和发现。

发明内容

为弥补现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种TTLL12基因新转录本的鉴定引物，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，用于准确的确定TTLL12基因一种新转录本的基因序列，对TTLL12基因的功能分析和研究具有重要的作用。

本发明提供一种TTLL12基因新转录本的鉴定引物，包括针对TTLL12基因特异性的PCR引物：所述TTLL12基因特异性的PCR引物为：5'-GATTACGCCAAGCTTAGAGCACACAGACGGCGCGGGTG-3'(SEQ ID NO.1)。

另外，本发明还提供了一种TTLL12基因新转录本的鉴定方法，包括以下步骤：

S1收集培养中的H1299细胞株，提取RNA；

S2用特异性的3'-RACE CDS引物反转录mRNA，形成cDNA链；所述反转录的条件为：

阶段1：42℃，90s；阶段2：70℃，10min；阶段3：4℃，保温；

S3以步骤S2中的cDNA链作为模板，用TTLL12基因特异性的PCR引物和UPM通用性引物扩增获得3'-RACE产物，所述PCR扩增条件包括：阶段1：94℃，30s；72℃，3min，5个循环；阶段2：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5个循环；阶段3：94℃，30s；72℃，3min，5个循环；阶段4：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5个循环；阶段5：94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min，5个循环；阶段6：4℃，保温；

S4将步骤S3的3'-RACE产物进行琼脂糖电泳，回收3'-RACE产物，连接到载体上，进行一代测序。

进一步地，所述步骤S2中的特异性的3'-RACE CDS引物为：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO.2)。