[发明专利]奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位疫苗的组合物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位疫苗的组合物及其制备方法和应用。该组合物包含α‑溶血素蛋白、β‑溶血素蛋白、PVL‑S蛋白以及药学上可接受的佐剂或α‑溶血素蛋白、β‑溶血素蛋白、PVL‑F蛋白以及药学上可接受的佐剂；其制备方法包括以下步骤：1)分别制备α‑溶血素蛋白、β‑溶血素蛋白、PVL‑F蛋白、PVL‑S蛋白；2)将1)中制备的α‑溶血素蛋白、β‑溶血素蛋白、PVL‑F蛋白或α‑溶血素蛋白、β‑溶血素蛋白、PVL‑S蛋白制备成抗原液；3)根据制备的组合物的体积，准备好硫柳汞，并将准备好的硫柳汞加入到2)抗原液中制备成水相；4)将水相与ISA 201 VG佐剂按照体积比46:55混合乳化。该组合物能诱发机体产生特异性抗体，产生很好的交叉保护反应。

技术领域

本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用。属于兽用疫苗技术领域。

背景技术

奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病之一，主要是奶牛乳腺组织受到微生物感染后而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的90％以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。

当前奶牛乳房炎的治疗主要是抗生素治疗。抗生素用于治疗奶牛乳房炎已有50多年的历史，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂量、不科学使用抗生素，造成了敏感性细菌消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微；另一方面，随着生活水平的提高，牛奶中抗生素残留是一个非常严重的健康问题。

用疫苗防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前，研制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、灭活不彻底等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极为重要。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏染色阳性的球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。

α-溶血素(α-hemolysin)，亦称α-toxin，是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素属于中空形状的β-桶状结构细菌毒素家族，相对分子质量为33,200，由297个氨基酸组成，其结构基因为hla。α-溶血素对多种哺乳动物红细胞具有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏了膜的完整性，造成细胞溶解。将α-溶血素第35位组氨酸突变为丙氨酸后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用来免疫动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。

β溶血素(亦称β-toxin)就是其毒素之一，它具有白细胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330个氨基酸组成的单链多肽，分子量为37～39kDa，其等电点(pI)高于9。β溶血素是一种镁依赖神经酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸胆碱，β溶血素依靠这种酶活性，水解组成细胞膜的磷脂双分子层，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，引起溶血。将β溶血素进行定点突变后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用来免疫动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。