[发明专利]一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用

权利要求书

1.双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在制备Tn抗原、T抗原或糖肽中的应用，其特征在于，步骤如下：

将转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶与糖基供体、糖基受体溶液混合，配制成pH 5.0～6.0的反应体系，反应体系中，糖基供体反应浓度为5～10mM，糖基受体反应浓度为200～300mM，在45～55℃条件下，反应10～120 min，终止反应，纯化，制得Tn和T抗原以及相应糖肽；

所述转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述糖基供体为对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖或对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖-β1,3-D-半乳糖；

所述糖基受体为丝氨酸、苏氨酸或氨基酸序列为STAPPA的短肽。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的反应浓度为0.1～0.9 U/ml。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，制备方法如下：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆菌BL21（DE3），制得重组大肠杆菌；

（2）将步骤（1）制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细胞破碎、纯化，制得转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum）JCM1217的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得，PCR引物核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-CGCGCATATGATGGAATTCACCGTATCCGGCACTA -3’

引物R:：5’-ATATAAGCTTGTGATGCGGGCAGTCGGTGATG -3’

PCR体系如下，总体积100µL：

10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20µmol/L引物F 2μL、20µmol/L引物R 2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μLTaKaRaLATaq酶1μL，超纯水76μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养条件为：37℃、150～180r/min培养至OD₆₀₀为0.4～0.8。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养基为LB培养液，配制方法如下：

蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0，121℃灭菌20分钟。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养基还包括浓度为40～60µg/mL的氨苄霉素。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养为在扩大培养后，向培养液中加入IPTG，使培养液中IPTG的浓度为0.1～0.5 mM，在16～25℃、100r/min继续过夜培养。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制，pH为6.0。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纯化采用HPLC进行纯化。