[发明专利]一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用

说明书

本发明涉及一种双功能转糖基α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用。该酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，双功能转糖基α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述双功能α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶可以高效合成Tn抗原和T抗原以及相应糖肽，所采用的α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶在以丝氨酸、苏氨酸或短肽(STAPPA)为受体底物的反应体系中合成GalNAc‑α‑Ser/Thr、Galβ1‑3GalNAc‑α‑Ser/Thr和GalNAc/Galβ1‑3GalNAc‑α‑STAPPA糖缀合物的反应过程中，产率显著高于现有已知相关酶，具有潜在的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用，特别涉及利用一种同时具有内切酶和外切酶活性的双功能α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶合成T抗原和Tn抗原以及相应糖肽的方法，属于基因工程技术领域。

技术背景

α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(α-N-Acetylgalactosaminidase，EC.3.2.1.49)是一类重要的糖苷水解酶，催化α-N-乙酰氨基半乳糖苷键的水解，广泛分布于细菌、真菌、植物和动物中，根据氨基酸序列同源性归属于糖苷酶家族GH27、GH36、GH109和GH129(http://www.cazy.org/)。其中，细菌来源的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在GH36、GH109、GH129个家族中有分布，真核生物来源的主要属于GH27。该类酶既可以水解简单的α-N-乙酰氨基半乳糖苷，也可以作用于含α-N-乙酰氨基半乳糖苷键的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶不仅具有水解功能，在体外合适的反应条件下还具有转α-N-乙酰氨基半乳糖苷的活性，合成重要N-乙酰氨基半乳糖苷化合物，应用于基础研究、农业和医药等领域，但目前报道的酶转糖基产物产量很低。

α-N-乙酰氨基半乳糖苷化合物的合成具有重要意义，如T抗原(Galβ1-3GalNAc-α-Ser，Galβ1-3GalNAc-α-Thr)和Tn抗原(GalNAc-α-Ser，GalNAc-α-Thr)属于Mucin-type O-glycan，但目前糖苷酶法合成Tn抗原(GalNAc-α-Ser，GalNAc-α-Thr)的产率不超过10％；合成T抗原(Galβ1-3GalNAc-α-Ser，Galβ1-3GalNAc-α-Thr)的产率不超过17％；合成相应糖肽的产率不超过11％。未见一种酶同时具有内切酶和外切酶活性的双功能，能够合成T抗原和Tn抗原以及相应糖肽的报道。由于现有的合成方法均存在局限性，使得α-N-乙酰氨基半乳糖类糖缀合物的商品价格一直非常昂贵，需要寻找新的酶和经济有效的合成方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用。

发明概述

本发明的技术要点是发现了一种同时具有内切酶和外切酶活性的双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，并利用该酶以对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖或对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖-β1,3-D-半乳糖为糖基供体，以丝氨酸、苏氨酸或短肽为受体，一步转糖基反应高效合成Tn抗原和T抗原以及相应糖肽。

发明详述

一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在制备Tn抗原、T抗原或糖肽中的应用。

上述应用，步骤如下：