[发明专利]一种提高大肠杆菌积累丙酮酸的方法

说明书

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种提高丙酮酸积累的大肠杆菌基因工程菌构建方法和生产应用。本发明所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在野生型出发大肠杆菌中删减乳酸脱氢酶的编码基因，丙酮酸氧化酶的编码基因，磷酸转乙酰酶的编码基因和乙酸激酶的编码基因，构建得到积累丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌KLPP。以KLPP出发，通过Tn5转座子建立突变库和高通量筛选获得丙酮酸积累提高的突变菌株，通过全基因组重测序发现提高丙酮酸积累的基因。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到发现的新的影响丙酮酸积累的基因及改造大肠杆菌（Escherichia coli）提高其丙酮酸积累的方法和利用该方法构建丙酮酸生产菌。

背景技术

丙酮酸是生物代谢过程中承上启下的关键中间产物，同时它为糖酵解途径和三羧酸循环提供原料，并且为生物的各项生命活动提供必需的能量。此外，它还广泛应用于医药、食品、饲料、日化、农药、生化研究与细胞培养等领域。随着我们对丙酮酸需求量的不断增加，如何找到一种环保、可持续的大量获得丙酮酸的方法显得尤为重要。

生产丙酮酸的方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法三种。由于发酵法具有产品纯度高、成本低、转化率高、对环境污染小等优点，已成为国内外最受青睐的生产方法。对生物发酵法来讲，寻找合适的生物发酵的基因工程菌是最关键的，自然界中有很多的微生物可以合成丙酮酸，如：球拟酵母、假丝酵母、酿酒酵母、大肠杆菌属等。通过代谢工程手段有效地改造上述微生物的代谢途径，可以获得优良高产菌株。沈冬钱等[生物工程学报, 2009, 25(9): 1345-1351]敲除大肠杆菌lpdA基因后，突变菌可以在不同糖为碳源下积累丙酮酸，得率都达到了0.8 g/g以上。Yihui Zhu等[Appl Environ Microbiol,2008, 74(21): 6649-6655]在大肠杆菌中敲除多个丙酮酸副产物基因，经发酵优化后，发酵罐分批补料44 h产丙酮酸90 g/L，得率0.68 g/g。于莹等[生物技术通报, 2016, 32(8):226-232]在谷氨酸棒杆菌中敲除了丙酮酸支流代谢途径基因，利用4.5%的葡萄糖复合培养基，基因工程菌经摇瓶发酵48 h，丙酮酸的浓度达到 14.6 g/L，比野生菌提高了32.5倍。Yoshikazu Kawata等[AMB Express,2016, 6(1):22]发现在培养Halomonassp. KM-1时，当培养基中硝酸钠的浓度增加时，导致丙酮酸的分泌增强，培养48 h，野生型Halomonas sp.KM-1可以产生63.3 g/L丙酮酸。Svetlana V. Kamzolova等[Appl Microbiol Biotechnol,2016, 100(17): 7689-7697]在Blastobotrys adeninivorans发酵中限制硫胺素来干扰硫胺素依赖的丙酮酸脱氢酶功能，可以产生43.2 g/L的丙酮酸。目前代谢工程改造主要集中于丙酮酸代谢途径及副产物代谢相关基因的改造，进一步改造的靶点基因不明确，通过诱变是一种方法。

基于传统诱变的方法，难以对发生有效突变的菌株进行快速地基因位点定位，无法精确的发现控制菌株高产的关键基因。而利用Tn5转座子来构建载体进行随机突变则不然，它通常被用于发现特定功能的未知基因，能够保证单基因插入突变来进行全基因改造，而且没有大量的无效突变背景干扰，能够进行基因组水平的随机插入，Wang等[MicrobCell Fact, 2016, 15(1): 101]利用Tn5转座子插入诱变用于构建运动发酵单胞菌中的较高耐盐性菌株，诱变产生200个运动发酵单胞菌的突变体，筛选到耐盐性比野生型高达2％的突变菌株ZMT2，并且找到himA基因，这个基因的破坏在响应耐盐中起着重要的作用。因此我们把这种方法应用到菌株的遗传改造过程中，为基因工程菌的构建提供有效的改造靶点。

发明内容

本发明的一个目的是发现新的大肠杆菌中可以提高丙酮酸积累的基因。