[发明专利]一种构建耐盐酵母菌株的新方法

权利要求书

1.一种构建耐盐酵母菌株的新方法，其特征在于：步骤如下：

⑴以野生型T酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株WM2；

⑵构建SPT15基因突变库；

⑶构建SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库；

⑷将构建好的重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库导入到W303中，选取优势菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到WM2中，即构建出新的耐盐T酵母菌株。

2.根据权利要求1所述的构建耐盐酵母菌株的新方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴以野生型T酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株WM2；

⑵同时，以酿酒酵母为模板，构建转录因子SPT15基因突变库；

⑶将启动子基因连接到质粒YEplac195中，即得到质粒YEplac195-P；

⑷将终止子基因连接到步骤⑶中构建的质粒YEplac195-P中，即得到质粒YEplac195-P-T；

⑸将步骤⑵中构建的SPT15基因突变库连接到步骤⑷中质粒YEplac195-P-T中，即得到质粒YEplac195-P-T-SPT15库；

⑹将步骤⑸中构建的质粒YEplac195-P-T-SPT15库导入到W303中，选取优势菌株提取质粒；

⑺从步骤⑹获得的菌株中提取质粒，将该质粒导入到步骤⑴中构建的WM2中，即构建出新的耐盐T酵母菌株。

3.根据权利要求1或2所述的构建耐盐酵母菌株的新方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴以野生型T酵母为出发菌株，利用最佳的紫外诱变条件对其进行诱变处理，最佳的紫外诱变条件为：在诱变剂甲基磺酸乙酯质量百分数为1％的条件下，取OD660＝1时期的T酵母，在紫外照射距离为25±1cm，对其进行诱变55min；

然后，在含盐的尿嘧啶缺陷型平板和YPD平板上对经过紫外线照射处理后的T酵母进行涂布对照筛菌，将在尿嘧啶缺陷型平板上不能生长、在YPD平板上生长的菌株进行传代处理，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型耐盐菌株WM2；

其中，所述含盐的尿嘧啶缺陷型平板为：

不添加尿嘧啶的完全极限培养基，调节pH至7.5，115℃灭菌20min制得的平板；

⑵运用易错PCR技术，在反应体系中，设置退火温度为42-58℃，Mg²⁺终浓度在1mM以上，对转录因子SPT15进行大量扩增，收集得到含有SPT15的大量易错PCR产物，用乙醇醋酸钠法纯化后，得到SPT15基因突变库，-20℃存储备用；

所用易错PCR反应体系为：

⑶构建SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库；

具体步骤如下：

①使用SphI和HindⅢ双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的200bp PCR产物以及质粒载体YEplac195，使用KpnI和SacI双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的400bp PCR产物以及质粒载体YEplac195-P，使用PstI和SalI双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的720bp PCR产物以及YEplac195-P-T，37℃酶切1-2h；

其中，所述200bp PCR产物即为启动子，其所使用的上引物为：SEQ 03；下引物为：SEQ 04；所述400bp PCR产物即为终止子，其所使用的上引物为：SEQ 05；下引物为：SEQ 06；所述720bp PCR产物即为SPT15基因片段；

②在80℃将限制性内切酶进行失活处理5min，将DNA聚合酶连接反应体系放在22℃的培养箱或室温下恒温反应4h或过夜，通过连接得到重组质粒库YEplac195-P-T-SPT15；

⑷将构建好的重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库导入到W303菌株中，并进行培养，在长出的菌落中随机挑取数个菌株，从中筛选耐高盐的优势菌株，对耐盐性好的菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株WM2中，通过培养做Dilution验证，从中筛选耐盐性最高的菌株，即构建出新的耐盐酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的构建耐盐酵母菌株的新方法，其特征在于：所述步骤⑸中使用电转化方法将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株WM2中。