[发明专利]一种构建耐盐酵母菌株的新方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学、分子生物学及食品发酵交叉领域，涉及基因工程技术领域，尤其涉及转录因子SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15的构建及其应用，尤其是一种构建耐盐酵母菌株的新方法。

背景技术

目前国内外针对SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15的构建及其应用，最主要的发现是其能通过大肠杆菌进行表达，而对于SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15能否在T酵母中进行表达，还尚未发现。

酱油是中国传统的调味品，其发酵工艺包括低盐固态和高盐稀态两种。而酱油的高盐稀态发酵工艺的主要是需要加入耐盐酵母(简称T酵母)来增强酱油的风味品质等。高盐稀态发酵盐水浓度要在16％以上，这就要求添加的酵母具有较高的耐盐性，因此筛选耐高盐的酵母菌株成为添加酱油风味的重要手段之一。

T酵母作为酱油发酵的主要菌株之一，有一个复杂的耐盐系统，使得它在高盐环境中保持正常的生理活动和新陈代谢的发酵。在过去二十年中，很多研究已经开始调查其对高盐的适应机制，主要集中在它的等离子膜、ATP酶和Na⁺/H⁺转运蛋白。盐对酵母新陈代谢的影响开始被研究，例如在酱油生产过程中酯类挥发物的变化，细胞生长和在高盐环境中糖的消耗。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献(以下简称对比文件1)：

耐盐耐酸酵母提取物及其制备方法和应用(CN104982875A)，由活性酵母依次加入酵母抽提酶、中性蛋白酶、复合酶、核酸酶与风味酶，调节pH至4-10，同时升温至30-90℃，酶解反应一段时间，然后升温灭酶，再离心分离得到上清液即为酵母水解液，再进行美拉德反应制得的。包括如下步骤：(1)酵母水解液制备以活性酵母为原料，向其中加水进行搅拌均匀，然后依次加入酵母抽提酶、中性蛋白酶、复合酶、核酸酶与风味酶,调节pH至4-10，同时升温至40-90℃，酶解反应一段时间，然后升温灭酶，再离心分离得到上清液即为酵母水解液；(2)热反应将步骤得到的酵母水解液与还原性单糖进行美拉德反应,即得耐盐耐酸酵母提取物。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献的耐盐酵母菌株构建方法存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种构建耐盐酵母菌株的新方法，该方法扩大了对于转录因子SPT15突变库的研究范围，成功地将含有SPT15的 YEplac195-P-T-SPT15重组体质粒在T酵母尿嘧啶缺陷型菌株WM2中表达出来，得到一种构建耐盐酵母菌株的新方法，将该方法所构建出的新的耐盐T酵母菌株用于酱油发酵中，待发酵成熟后测定氨基酸态氮的含量，发现在发酵酱油的过程中能产生更多的氨基酸态氮，验证其在酱油酿造中具有明显优势。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种构建耐盐酵母菌株的新方法，步骤如下：

⑴以野生型T酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株WM2；

⑵构建SPT15基因突变库；

⑶构建SPT15重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库；

⑷将构建好的重组质粒YEplac195-P-T-SPT15库导入到W303中，选取优势菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到WM2中，即构建出新的耐盐T酵母菌株。

而且，具体步骤如下：

⑴以野生型T酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株WM2；

⑵同时，以酿酒酵母为模板，构建转录因子SPT15基因突变库；

⑶将启动子基因连接到质粒YEplac195中，即得到质粒YEplac195-P；

⑷将终止子基因连接到步骤⑶中构建的质粒YEplac195-P中，即得到质粒YEplac195-P-T；

⑸将步骤⑵中构建的SPT15基因突变库连接到步骤⑷中质粒YEplac195-P-T中，即得到质粒YEplac195-P-T-SPT15库；

⑹将步骤⑸中构建的质粒YEplac195-P-T-SPT15库导入到W303中，选取优势菌株提取质粒；

⑺从步骤⑹获得的菌株中提取质粒，将该质粒导入到步骤⑴中构建的WM2中，即构建出新的耐盐T酵母菌株。

而且，具体步骤如下：