[发明专利]一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用

权利要求书

1.一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备DNA折纸探针；

2)通过所述DNA折纸探针在目标DNA上进行特异性标记；以及

3)在原子力显微镜下对所述标记过的目标DNA进行成像观察。

2.根据权利要求1所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述步骤1)包括：长链DNA作为主链与若干条短链进行杂交反应，其中一条短链包含部分未与长链杂交的序列，退火后形成各种二维结构，即DNA折纸探针。

3.根据权利要求2所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述步骤2)包括：分别提供单链的目标DNA以及一种“双嵌段”引物，利用Vent DNA聚合酶进行聚合酶链反应，使所述“双嵌段”引物的一端与所述单链的目标DNA的特定位点结合并有效地延伸，获得标记有“双嵌段”引物的双链的目标DNA。

4.根据权利要求3所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：利用自然降温的方法，将过量的所述DNA折纸探针与标记有“双嵌段”引物的双链的目标DNA混合反应12小时以上，使所述“双嵌段”引物的另一端与所述DNA折纸探针杂交，获得经过DNA折纸探针特异性标记的双链的目标DNA。

5.根据权利要求4所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述步骤3)包括：将所述经过DNA折纸探针特异性标记的双链DNA滴在新剥离云母片上，静置吸附后利用氮气吹干，然后通过原子力显微镜在气相条件下观察。

6.根据权利要求5所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述步骤3)还包括：采用含有二价阳离子的1×TAE/Mg²⁺作为缓冲液，将所述经过特异性标记的双链DNA滴在新剥离云母片上静置吸附，利用水流的作用和阳离子缓冲液环境下的吸附力的平衡作用将所述经过DNA折纸探针特异性标记的双链DNA舒展开来，再在原子力显微镜下成像观察。

7.根据权利要求1所述的单分子基因分型方法，其特征在于，所述方法通过对DNA折纸探针形状和结构的区分来确定所述目标DNA上对应的基因信息，并结合快速扫描的原子力显微成像技术实现对所述目标DNA高通量的单分子基因分型。

8.一种根据权利要求1-7中任意一项所述的基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法在病人样本中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病人样本是一段双链DNA片段，所述应用还包括：所述双链DNA片段在进行特异性标记之前，首先采用lambda外切酶将双链变成单链，得到待检测的目标DNA。

10.一种根据权利要求1-7中任意一项所述的基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法在未知单倍型信息的实际样本中的应用。