[发明专利]一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测分析及生物学应用领域，更具体地涉及一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指生命基因组上单个碱基的增减和变化，在人群中出现的频率超过1％。除了极少数SNP之外，大多数SNP只有两个等位基因，因此SNP分型相对容易。SNP是人类基因组中最常见的遗传变异，在人类基因组中大约每1000个碱基对出现一个多态性位点。由于在基因组中分布广泛且分型较容易，它们已经成为基因组研究中重要的遗传标记。SNP基因分型(genotyping)就是确定个体的特定单核苷酸多态性位点的基因型(genotype)的过程，通过与其他个体或对照样本的序列的比较发现其特定位点的差别。由于单核苷酸多态性是最常见的基因变异，并且具有两个等位基因和高多态性，对SNP进行基因分型已经被广泛地应用于研究很多人类复杂遗传疾病易感基因的研究中。最近，对染色单体上相关联的单碱基多态性位点的区分(单倍型，haplotypes)用于研究全基因组关联确定的多态性位点正引起了越来越广泛的兴趣。但是现有的单倍型分型方法还无法实现实际应用，存在诸多的问题：如无法完全区分两条同源染色体、方法复杂不易操作且成本很高、技术本身不成熟等。

利用长链作为骨架链(scaffold)来构建DNA纳米结构这一创造性的想法源于Shih在2004年的工作，他利用长度为1.7knt的单链DNA结合五条短链构建了八面体结构。而在2006年Rothemund则进一步利用M13噬菌体的长度为7249nt的基因组DNA作为主链，通过设计人工合成的216条短链将其弯曲“折”成了各种二维结构，即“DNA折纸”。需要注意的是，利用的环状单链DNA，定义为脚手架，与订书钉链互补配对，可以有效地折叠成给定的几何图形。DNA折纸具有很好的位点可寻址性且位点间的“分辨率”可以达到4-6nm。

在DNA纳米技术领域，开创者Seeman教授为数不多的关于DNA纳米技术应用的工作之一就是利用DNA折纸用于单核苷酸多态性可视化。目前，研究者们取得的突破性进展主要有：一、利用链置换反应发展了一种荧光DNA探针用于区分一段目标DNA序列上单个碱基的多态性；二、利用碳纳米管AFM探针对DNA实现直接可视单倍型；三、基于荧光分子标记和纳通道芯片的方法，利用全内置反射显微镜成像技术对长片段的目标DNA序列进行直接单倍型成像。但是，截至目前，尚未实现对单倍型分型的超分辨成像。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用，从而解决现有技术中还无法实现对单倍型分型的超分辨成像的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法，所述方法包括以下步骤：1)制备DNA折纸探针；2)通过所述DNA折纸探针在目标DNA上进行特异性标记；以及3)在原子力显微镜下对所述标记过的目标DNA进行成像观察。

所述步骤1)包括：长链DNA作为主链与若干条短链进行杂交反应，其中一条短链包含部分未与长链杂交的序列，退火后形成各种二维结构，即DNA折纸探针。

如本发明的背景部分介绍，DNA折纸探针具体可按照Rothemund和Seeman的方法进行制备。此外，在需要链霉亲和素(streptavidin，STA)修饰DNA折纸时，10倍过量的链霉亲和素加入折纸溶液中，所获得的DNA折纸探针通过琼脂糖电泳纯化并利用Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns浓缩回收得到。

所述步骤2)包括：分别提供单链的目标DNA以及一种“双嵌段”引物，利用Vent DNA聚合酶进行聚合酶链反应，使所述“双嵌段”引物的一端与所述单链的目标DNA的特定位点结合并有效地延伸，获得标记有“双嵌段”引物的双链的目标DNA。

延伸目标单链DNA形成双链DNA的过程利用一种Vent(exo^-)DNA聚合酶，其既没有5’到3’的核酸外切酶活性，也不具有3’到5’的核酸外切酶校读活性，尽管这样会对其保真性有一定的影响，但这能保证在延伸过程中上游的延伸不会将下游的引物取代下来，因此保证了标记的可靠性。