[发明专利]提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌

说明书

本发明公开了提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌。所述方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶；或者失活乙酰乳酸脱羧酶并且高水平表达吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶；或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶，高水平表达吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶。该方法中酶失活和高表达后的克雷伯氏肺炎杆菌为改造菌。将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中改造的克雷伯氏肺炎杆菌将培养基中的碳源转化成异丁醇。本发明提供的提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，改造的菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇。

背景技术

异丁醇主要用作原料合成其他化学品，包括乙酸异丁酯、异丁烯等产品。异丁烯作为平台化合物可用于合成甲基叔丁基醚(MTBE)、乙基叔丁基醚(ETBE)、异辛稀、对苯二甲酸等燃料和化学品。MTBE和ETBE可以提高汽油辛烷值，作为汽油添加剂广泛使用。异丁醇具有与汽油接近的能量密度，吸水性弱，挥发性低，辛烷值高，这些特点使得异丁醇成为一种潜在的液体燃料。

异丁醇是一种重要的石油化学品，是石化工业中蒸汽裂化和催化裂化的副产物。除石油工业外，化学法合成异丁醇主要采用合成气为原料。包括直接利用合成气在高温高压下催化合成异丁醇和先在低温下合成甲醇和高级醇，混合醇再在高温下催化形成异丁醇两种方法。另外可以利用甲醇和乙醇溶液作为原料通过催化合成异丁醇。

目前仅发现酿酒酵母等少数微生物可以合成微量的异丁醇，商品异丁醇由化学合成法生产(Nature,2008,451,86-89)。目前报道的其他生物法合成异丁醇都是在宿主细胞中构建新的代谢途径来实现。将来源于将乳脂乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因克隆到大肠杆菌，并同时表达alsS，ilvC和ilvD基因，工程菌株可以利用葡萄糖合成3g/L的异丁醇(生物技术通报，2011,8,208-212)。将宿主大肠杆菌基因组的pflB，frdAB，fnr和AdhE基因敲除后，工程菌株的异丁醇产量提高到4.2g/L(生物技术通报，2012,170-175)。利用谷氨酸棒杆菌为宿主，表达来源于枯草芽孢杆菌的alsS基因，来源于谷氨酸棒杆菌的ahdA，ilvC和ilvD基因，来源于乳脂乳球菌的kivd，工程菌株28小时可以合成2.6g/L的异丁醇(ApplMicrobiol Biotechnol,2010,87:1045–1055)。利用枯草芽孢杆菌为宿主细胞，表达枯草芽孢杆菌来源的alsS基因，酿酒酵母来源的adh2基因，来源于乳脂乳球菌的kivd基因，通过其他基因改造后获得的工程菌株可以合成2.62g/L的异丁醇(Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:577–589)。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。目前未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的公开报道。

发明内容

本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于提升菌株生产异丁醇的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，该方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶；或者失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶并且高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶；或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶，高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶。

本发明还提供了改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶失活、并且吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活、并且吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌。