[发明专利]鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO₂培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；

(2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；

(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：

(1)细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO₂培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；

(2)禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO₂培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；

(3)制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。

3.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

4.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。

5.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液。

6.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：

(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；

(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；

(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。

7.根据权利要求6所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。

8.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。