[发明专利]鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

鸡新城疫(ND)俗称鸡瘟，是由鸡新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击。

H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现仅为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。更重要的是，H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流行，给人类健康带来了严重的威胁。

禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。其中，禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。

目前针对鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗不断推出，可避免需要多次应用相应的单项灭活疫苗引起的手续繁琐、使用不便、防疫成本较高等问题。如公开号为CN 105664150 A的中国专利申请“一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗”中所述三联疫苗的制备方法为分别将鸡新城疫、禽流感病毒接种鸡胚收获抗原，将禽腺病毒接种鸡肝细胞收获抗原，然后将各自抗原混合，再进行抗原的浓缩灭活、成品乳化。但所述的禽腺病毒以原代鸡肝细胞进行培养，制备繁琐、易污染、难以到达高效转染，不利于实验操作。因此，有必要提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。

本发明提供的技术方案为如下：

本发明提供一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO₂培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；

(2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；

(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。

进一步地，上述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：

①细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO₂培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；

②禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO₂培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；

③制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液；