[发明专利]一种针对pBpp蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种针对pBpp蛋白的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；

2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到pET28c载体上，即得到重组质粒pET28c-pBpp；

3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；

4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pET28c-pBpp，将其转化入大肠杆菌E.coli BL21，即得到重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21；

5)培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21，收集菌体；

6)利用EQ Buffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎直至溶液澄清为止，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于EQ Buffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于Wash Buffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；

7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱Buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；

8)取步骤7)所得的上清液，以13000rpm的转速离心30～60min，取上清装入透析袋，先利用1×PBS缓冲液透析3h，透析过程中先后更换PBS缓冲液3次，透析后用25％体积浓度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pBpp蛋白。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤5)中用于培养重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21的培养基是含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于步骤5)中，初始向培养基中接入的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21菌液量为培养基体积的1％。

4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于步骤5)中培养至培养液OD值为0.6时向其中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于25℃条件下诱导6～8h，结束培养。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤2)中pBpp蛋白表达基因与pET28c载体的连接是先经NcoI和XhoI双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到pET28c上。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤6)中所述的以4000rpm的转速离心15min，被离心物均是装满于15ml离心管中进行离心的。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于步骤6)镍珠在EQ Buffer中的悬浮，二者的体积比为1:15。