[发明专利]一种针对pBpp蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种针对pBpp蛋白的纯化方法。

背景技术

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。

目前，我国Ⅱ型糖尿病的患病率增长较快，据1979年在我国30万人口中的调查，糖尿病患病率为0.6％，1989年为2.02％，年均增长0.1％左右，1994年我国普查20万人口，患病率已上升为2.5％，目前20～75岁人群中糖尿病患病率约为3％左右。糖耐量低减患者不低于3％。一般而言，在我国富裕地区的糖尿病患病率高于贫困地区，城市高于农村，肥胖高于正常体重，高龄高于低龄。目前我国糖尿病发病率为1/1000左右，50岁以上的平均患病率为7％以上，40岁以下患病率随着年龄的增长而升高，患者高峰年龄在50～70岁。

我国患病率以北京、辽宁、宁夏、甘肃、云南、福建较高，据1979～1997年调查结果表明为全国之首，而新疆、贵州、山西较低。发病率较高的北京、辽宁与最低的贵州、新疆之间相差达10倍，城市发病率高于农村1～4倍，广西地区调查证明，产糖地区糖尿病患病率高于非产糖区2倍。

尽管多种治疗方法可以控制血糖浓度，但目前仍未实现糖尿病的根治。现有技术中，药物干预仍是糖尿病治疗的主要手段，其中以GLP-1类似物、DPPIV抑制剂等应用较为广泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein)，是指可诱导胰腺中β细胞增殖、进而促进胰岛素分泌的一类功能性蛋白，由于其不直接参与人体糖代谢机制，因此降糖作用较为温和，对人体副作用较小。然而，此类蛋白的规模化生产是目前制约其临床应用的直接技术问题，其中人源蛋白的获取较为困难，而其他生物来源的pBpp蛋白其药效及安全性又难以得到保障。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对pBpp蛋白的纯化方法，以解决现有技术中pBpp蛋白难以规模化制备的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是以基因工程手段获得的、由微生物所表达的重组pBpp蛋白，其纯化较为困难。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对pBpp蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；

2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到pET28c载体上，即得到重组质粒pET28c-pBpp；

3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；

4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pET28c-pBpp，将其转化入大肠杆菌E.coli BL21，即得到重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21；

5)培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21，收集菌体；

6)利用EQ Buffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎直至溶液澄清为止，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于EQ Buffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于Wash Buffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；

7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱Buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；