[发明专利]一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法

权利要求书

1.一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；

2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；

3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；

4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于步骤1)中用于分离微生物的培养基包括LB基础培养基，MRS固体培养基，BHI固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基，BSM固体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于步骤1)中所述从阴道分泌物中分离微生物，具体包括以下操作：取阴道分泌物加入至1.5ml无菌的EP管中，用无菌PBS缓冲液按照10¹～10⁶进行倍比稀释，分别以50μL的量涂布于固体培养基中，培养48h。

4.根据权利要求3所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于所述阴道分泌物是保存于-80℃环境下且处于甘油环境中的。

5.根据权利要求3所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于所述固体培养基包括LB基础培养基，MRS固体培养基，BHI固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基，BSM固体培养基；其中涂布于MRS固体培养基、LB基础培养基、BSM固体培养基中的样品经过10²～10⁴倍稀释；涂布于BHI固体培养基和含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基中的样品经过10³～10⁵倍稀释。

6.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于所述菌种鉴定包括：分别提取若干单菌落中微生物的DNA，经PCR扩增后测序，确定菌种类别。

7.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于步骤3)具体包括以下操作：

A)取所述若干菌株，分别接种于其所对应的液体培养基中，在CO₂培养箱中于37℃条件下培养至OD值为0.6；

B)将步骤A)所得的若干培养液每种取200μL，各与2mL精液、2mL含有Hela细胞的细胞培养液在15ml离心管中混合，在CO₂培养箱中于37℃条件下培养1～1.5h；

C)固液分离取沉淀，用PBS缓冲液清洗后加入甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察各实验组微生物对精细胞的粘附能力，据此筛选出目标菌株。

8.根据权利要求7所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于步骤C)中所述的固液分离是以1000rpm的转速离心；用PBS缓冲液清洗的次数为5次。

9.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于所述目标菌株包括卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌，格氏乳杆菌，阴道乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌。

10.根据权利要求1所述的一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，其特征在于所述冻干粉菌剂中含有细菌分泌产物或者细菌破碎后的碎片。